研究背景：早期发现原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)病灶并积极治疗,可以明显改善患者预后。常规的影像诊断技术B超、CT和MRI,在显示肝细胞癌的形态改变及血流供应情况有较好的应用价值,但是在鉴别诊断、全身分期和早期疗效评价中存在不足。新型影像诊断技术18F-FDG PET/CT显像虽然在肝细胞癌诊断和分期方面有一定的临床应用,但是它对高分化肝细胞癌诊断灵敏度低,很难很好地满足临床。研究发现,作为硫酸类肝素蛋白聚糖家族一员的磷酸酯酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3),是特异靶向肝细胞癌的分子。GPC3在成人正常组织中不表达,在80%以上的人肝细胞癌中GPC3高表达。L5(序列为RLNVGGTYFLTTRQ)是最新发现的GPC3受体特异性、高亲和性靶向多肽。采用荧光和正电子核素18氟(18F)标记L5有望成为肝细胞癌特异性靶向分子探针。研究目的：一、合成GPC3受体靶向多肽L5并验证该多肽与肝细胞癌细胞的结合能力,为进一步探针制备和肝细胞癌靶向性显像研究奠定基础。二、用5-羧基荧光素(5-carboxyfluorescein, FAM)标记L5多肽,制备荧光探针(FAM-L5),并用荧光显像方法研究该荧光探针的靶向性,评价该探针能否发展成为肝细胞癌的靶向荧光探针。三、用正电子核素18F标记靶向多肽L5制备PET分子探针(18F-L5),通过micro-PET/CT显像,研究该探针用于肝细胞癌显像的可行性。研究方法：一、靶向GPC3受体多肽L5及其荧光多肽FAM-L5的合成1.GPC3靶向多肽L5的化学合成采用固相9-芴甲氧羰基(Fmoc)肽化学合成方法合成L5。以氯三苯基氯树脂为载体,采用Fmoc氨基保护策略,固相合成L5(氨基酸序列为：RLNVGGTYFLTTRQ)。第一个氨基酸与树脂的连接采用对称酸酐法,反应结束后用适量的吡啶和乙酸酐封闭树脂上剩余的活性位点。后续氨基酸以HOBt/HBTU/DIEA为缩合剂依次连接。反应结束后,以三氟乙酸为主切割剂将目的肽段从树脂上裂解下来,合成产物经高效液相色谱(High Performance Liquid Chromato graphy, HPLC)分离、纯化、分析,质谱分析鉴定。2.荧光标记靶向肽FAM-L5的合成将5-羧基荧光素(FAM)与多肽L5(RLNVGGTYFLTTRQ)将5-羧基荧光素(FAM)与多肽L5(RLNVGGTYFLTTRQ)的末端氨基进行反应,将FAM结合和标记到多肽L5末端氨基上而制备荧光标记多肽探针FAM-L5。反应结束后,以三氟乙酸为主切割剂将目的肽段从树脂上裂解下来,合成产物经高效液相色谱分离、纯度,质谱分析鉴定。3.NOTA修饰多肽L5由中肽公司合成。二、荧光多肽FAM-L5的体外结合试验1.免疫荧光检测肝细胞癌HepG2细胞及正常肝细胞HL-7702细胞GPC3的表达选择对数期HepG2及HL-7702细胞做为研究对象,计数、铺板后,4%多聚甲醛固定,用稀释好的抗GPC3一抗于4℃孵育过夜；洗涤后,加入Cys3标记的二抗,洗涤后,观察荧光表达。2.体外肝细胞癌细胞株HepG2同荧光多肽FAM-L5的结合及竞争抑制试验1)细胞培养：肿瘤细胞株选用GPC3表达阳性的人肝细胞癌细胞株HepG2,对照组选用GPC3表达阴性的人正常肝细胞HL-7702。上述细胞在加有10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素的RPMI1640培养基中培养,隔天更换培养介质。细胞在含有5%二氧化碳温度为4℃的潮湿空气中在组织培养瓶内展开,当细胞铺满培养瓶后用0.05%胰蛋白酶(EDTA)和0.01 M磷酸缓冲液(pH=7.4)分离用于进一步细胞培养。2)结合试验：收集对数期生长的HepG2肝细胞癌和人正常肝细胞HL-7702并计以每孔1×105分别接种在24孔板内,37℃培养过夜。采用复孔方式,逐孔加入递增浓度(0 μM,1 μM,5 μM,10 μM,20 μM,40 μM)的FAM-L5溶液,4℃孵育1h,PBS清洗3次后,用倒置荧光显微镜(inverted florescence microscope)进行显像。白光显示细胞形态,蓝色激发光下观察细胞的荧光摄取情况,紫光激发状态下观察细胞核。3)竞争抑制试验：选择对数生长期HepG2肝细胞癌,每孔1×105置于24孔板内,采用复孔的方式,先在每孔内加入20mM未标记的L5溶液与肝细胞癌细胞在4℃环境中孵育。30min后,逐孔加入递增浓度(0 μM,1 μM,5 μM, 10 μM,20 μM,40 μM)的FAM-L5溶液,37℃环境中孵育1h, PBS清洗3次后用荧光显微镜观察细胞的对荧光多肽的摄取强度4)肝细胞癌HepG2细胞和正常肝细胞HL-7702细胞对于梯度浓度荧光探针FAM-L5的摄取对比定量分析①肝细胞癌HepG2细胞和正常肝细胞HL-7702培养至细胞处于对数期时,将细胞消化离心重悬后,1×105细胞传代于6孔板内,待贴壁后备用。②新鲜配制浓度分别为0μM、5 μm、10 μM、20 μM、40μM、60μM、80μM、 100μM、120μM FAM-L5的溶液。分别加入上述培养皿中,4℃孵育60min后弃去培养液,PBS溶液冲洗3次,每次5min,胰酶消化离心后,弃上清,所得细胞团内加入适量PBS,流式细胞仪分析相对细胞荧光强度。三、荧光多肽FAM-L5的体内试验1.裸鼠肿瘤模型的建立及确定1)裸鼠肿瘤模型的建立：肝细胞癌细胞株采用HepG2,选用对数生长期HepG2细胞,经胰酶消化及离心后,PBS洗涤细胞2次后,配置细胞悬液5×106/0.2ml/只,分别接种于4-6周龄的胸腺缺陷裸鼠右侧腋下。SPF环境下培养,3-4周待肿瘤逐渐增长致1cm时用于动物实验研究。对照组选用脑胶质瘤细胞系U87MG,选用对数生长期HepG2细胞,经胰酶消化及离心后,PBS洗涤细胞2次后,配置细胞悬液5×106/0.2ml/只,分别接种于4-6周龄的胸腺缺陷裸鼠右侧腋下。SPF环境下培养,3-4周待肿瘤逐渐增长致1cm时用于动物实验研究。2)组织病理学确定：为了确认所得到的肿瘤模型符合要求,将荷瘤鼠模型处死,切除肿瘤组织,用福尔马林固定,石腊包埋,将石腊包埋组织置切片机的组织支承架上,做3μm厚的组织切片,置于洁净的载玻片上,37℃干燥过夜,做HE染色。然后用光学显微镜确认肿瘤组织试验组是否为肝细胞癌,对照组是否为脑胶质瘤。2.FAM-L5在肿瘤组织及正常组织脏器内的摄取及分布研究经荷肝细胞癌HepG2细胞株和荷人胶质瘤U87MG肿瘤裸鼠的尾静脉注射FAM-L5(1mM,150μL),1小后处死动物,分离肿瘤组织及肝脏组织,先用含有DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole)的染色剂对细胞核进行染色,部分切片进行GPC3免疫荧光显像分析,然后在Olympus DP71荧光显微镜下(Olympus America, Center Valley, PA, USA)用蓝光观察FAM-L5在不同组织内的分布情况,绿光观察不同组织内GPC3表达情况。3.FAM-L5在荷肝细胞癌肿瘤模型体内的荧光生物学分布研究在暗室中,经鼠尾静脉注射FAM-L5(1mM,150μL) 1小时后,将荷瘤裸鼠麻醉处死,分离肿瘤及各脏器、组织后用生理盐水多次冲洗,然后将肿瘤和正常脏器置于干净的玻璃皿上,在Kodak in-Vivo Imaging System F (Kodak, American)下进行荧光显像测量肿瘤及各脏器、组织的荧光摄取量,比较肝细胞癌HepG2中瘤与正常组织和脑胶质瘤U87肿瘤组织对FAM-L5摄取差异的比较。4.荧光显像分析用荧光显像仪Kodak in-Vivo Imaging System F配置的Kodak MI分析软件进行图像分析。在荧光图像上沿肿瘤和各组织的边缘勾画感兴趣区(Region of interest, ROI),测量各感兴趣区内的荧光计数,计算肿瘤与正常组织的肿瘤／非肿瘤比值(tumor/non-tumor,T/NT ratios)。四、PET分子探针18F-L5的合成和micro PET/CT显像研究1.PET分子探针的合成利用氨基酰化反应合成18F-NFP-L5完成靶向多肽L5的放射性标记。18F-NOTA-L5放射性化学标记：应用A118F与NOTA-L5发生螯合反应,进行’8F标记。2. Micro PET/CT显像荷肝细胞癌HepG2裸鼠经尾静脉注射18F标记GPC3受体靶向多肽3.70～5.50MBq(100～150μCi) 1小时后用水合氯醛麻醉。实验动物置于俯卧位后行micro PET/CT显像,实验动物的体温用水循环加热板使其保持稳定。按程序经低剂量CT扫描后进行micro PET/CT扫描,扫描方式为3D采集,每床位10min,图像采用3D迭代法(有序子集最大期望值法)进行重建。利用Inven Research Workplace(IRW2.2)工作站进行数据处理,PET数据经CT衰减校正后利用滤波反投影法,重建冠状面、横断面、矢状面断层图像进行分析,并与CT图像融合,手动勾画肿瘤感兴趣区,工作站自动计算SUVave。统计学分析采用SPSS 19.0统计软件进行分析。HepG2细胞与HL-7702细胞与荧光多肽FAM-L5结合试验的相对荧光强度比较,采用独立样本t检验；荧光多肽活体显像时,实验组为荷HepG2肿瘤裸鼠与对照组为荷U87MG肿瘤裸鼠,其肿瘤／正常组织的相对荧光摄取强度比较采用配对样本t检验；P<0.05认为差异有统计学差异。结果一、靶向GPC3受体多肽及其荧光多肽FAM-L5的合成1.GPC3靶向肽L5的合成固相合成的GPC3靶向肽L5呈现为白色粉末。经质谱分析鉴定,主峰分子量(m/z:Da)为1626.1,与L5理论分子量1625.86相符,证明合成正确。经HPLC纯化、分析结果显示L5的纯度为99.15%。2.FAM标记荧光多肽FAM-L5的合成FAM-L5为黄色粉末。质谱分析鉴定,FAM-L5的主峰分子量(m/z, Da)为1985.0,与FAM-L5理论分子量1984.18相符,证明标记合成。经HPLC纯化、分析结果显示,FAM-L5的纯度为98.44%。3. NOTA修饰L5的合成NOTA修饰L5为白色粉末,质谱分析鉴定,NOTA-L5的主峰分子量(m/z, Da)为1945.3,与NOTA-L5理论分子量2131.0相符,证明标记合成。经HPLC纯化、分析结果显示,NOTA-L5的纯度为95.4%。4.验证肝细胞癌HepG2细胞和人正常肝细胞HL-7702细胞表达GPC3受体的实验：经过细胞免疫荧光试验,共聚焦显像显示肝细胞癌HepG2细胞高表达GPC3受体,而人正常肝细胞HL-7702细胞低表达GPC3受体。5.荧光多肽FAM-L5与细胞的结合实验从定性及定量试验结果分析表明：高表达GPC3受体的肝细胞癌细胞HepG2细胞膜高摄取荧光多肽FAM-L5,摄取荧光强度随FAM-L5浓度提高而增强；在反应体系中加入未标记L5时,未标记多肽L5明显抑制荧光多肽FAM-L5与HepG2的结合试验。低表达GPC3受体的人正常肝细胞HL-7702细胞低摄取FAM-L5,结合反应的相对荧光强度明显低于肝细胞癌HepG2 (14640±4155 vs 5672±2812,t=-4.729,P=0.001)。二、荧光多肽FAM-L5的体内试验1.裸鼠肿瘤模型的建立4周龄无胸腺裸鼠皮下接种HepG2细胞,饲养14天左右可见肿瘤结节,待4至6周肿瘤增大至1.0cm左右用于试验。共接种6批,每批5只,共30只,其中25只成瘤,5只无肿瘤生长,成瘤率为83.3%。为验证肿瘤模型是否符合要求,将其中1个肿瘤切下来进行病理组织学检测,病理结果显示符合肝细胞癌改变。相同条件的无胸腺裸鼠皮下接种U87MG细胞,饲养14天左右可见肿瘤结节,待4-6周肿瘤增大至1.0cm进行试验。共接种3批,每批5只,共15只,其中12只成瘤,3只无肿瘤生长,成瘤率为80%。为验证肿瘤模型是否符合要求,其中1只肿瘤切下来进行病理组织学检测,病理结果显示符合脑胶质瘤改变。2.荧光多肽FAM-L5在肿瘤组织中的摄取及分布研究经荷肝细胞癌裸鼠尾静脉注射FAM-L5(1mM,150μL)1小时后,分离肿瘤组织,制作切片观察荧光标记多肽在肿瘤内的分布情况,结果显示肿瘤组织内可见明显荧光聚集。分离正常肝组织制作切片,观察到正常肝组织内有荧光分布但荧光强度明显低于肿瘤组织。三、.肝细胞癌FAM-L5荧光受体显像研究研究结果显示注射FAM-L5 1小时后,肝细胞癌HepG2肿瘤组织内呈现FAM-L5明显高摄取,而正常的肝脏组织仅见荧光轻微摄取,相对荧光强度肿瘤／肝脏比值为14.28+7.90。从体内分布看,该荧光多肽主要通过胆囊-肠道途径排泄,注射1小时后,大部分荧光分布于胆囊及肠道内。脑、双肺、心脏、脾脏、双肾及肌肉组织内荧光分布均很低,提示非特异性摄取低。对照肿瘤人脑胶质瘤U87MG,静脉注射FAM-L5 1小时后,U87 MG肿瘤部分荧光摄取较低,仅略高于正常肝脏组织,其肿瘤／正常肝脏比值为1.44+0.53。两种肿瘤摄取FAM-L5的相对荧光强度比较,肝细胞癌HepG2中瘤摄取FAM-L5的相对荧光强度明显高于脑胶质瘤U87MG(14.28±7.90 vs 1.44±0.53,t=3.69, P=0.008)。四、PET分子探针18F-L5的研制及PET/CT显像研究1.18F-NFP-L5和18F-AlF-NOTA-L5的放化标记18F-NFP-L5的放化标记：顺利合成了18F-NFP-L5,实现了靶向多肽L5的放射性标记,标记产物为约为10%。18F-AlF-NOTA-L5的放化标记：以NOTA-L5为反应前体,采用Al18F螫合反应,实现’8F标记NOTA-L5。总标记时间为60min,标记率为14.6%-69.8%。2.荷瘤裸鼠micro PET/CT显像研究2.118F-NFP-L5显像结果：Micro PET/CT显像研究,荷肝细胞癌HepG2裸鼠在注射显像剂18F-NFP-L560分钟后,肿瘤组织可见明显放射性浓聚,且放射性浓聚程度明显高于周围软组织,其中肿瘤／肝脏比值为1.46。2.218F-AlF-NOTA-L5显像结果：Micro PET/CT显像研究,荷肝细胞癌HepG2裸鼠在注射显像剂18F-NOTA-L5 60分钟后,肿瘤组织可见明显放射性浓聚,且放射性浓聚程度明显高于周围软组织,但是部分图像中呈现出裸鼠全身骨骼摄取明显增高,部分图像显示双肺内见放射性物质沉积。结论1.本研究成功合成了靶向GPC3受体的多肽L5,合成纯度为99.15%,可满足研究需要。2.成功用FAM标记L5,成功制备荧光探针FAM-L5,纯度为98.44%,可满足体内及体外反应的需求。3.体外荧光探针FAM-L5与细胞的结合试验表明FAM-L5能被高表达GPC3受体的细胞HepG2大量摄取,其摄取符合受体-配体竞争结合规律。4.肿瘤组织荧光显像研究表明：荧光多肽FAM-L5能在肝细胞癌肿瘤组织中大量聚集。5.正常裸鼠体内FAM-L5的荧光生物学分布研究显示FAM-L5主要经胆肠系统排泄。6.成功合成了PET探针18F-NFP-L5和18F-NOTA-L5,其中18F-NOTA-L5标记率为14.6%-69.8%,标记率较高,可以进行大量动物试验。7.经micro PET/CT显像研究显示,18F-NFP-L5和18F-NOTA-L5能靶向肝细胞癌肿瘤组织。8.FAM-L5、18F-NFP-L5及18F-NOTA-L5都能靶向高表达GPC3受体的肝细胞癌肿瘤组织,可以作为靶向GPC3受体的荧光探针及PET探针。