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第一部分川芎嗪对基因修饰神经干细胞的保护作用目的:构建SD乳鼠神经干细胞体外基因修饰模型,探讨TMP对神经干细胞基因修饰损伤的保护作用及其机制,为TMP作为组织工程神经保护剂,促神经损伤修复剂提供细胞学基础。方法:(1)分离SD乳鼠海马神经干细胞(NSCs)进行原代培养,将二代NSCs行神经巢蛋白(nestin)及诱导分化后的神经丝蛋白(NF-200)与胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组化鉴定。取二代神经干细胞行携带EGFP基因的逆转录病毒转染并更换完全培养基,然后按基因修饰对照组(GM control)、TMP实验组,溶媒对照组(Vehicle control)分组,同时设正常对照组(Normal control)。其中TMP实验组在DMEM/F12培养基中分别加入工作浓度为50、100、200和300μg/ml的TMP,溶媒对照组在DMEM/F12培养基中加入0.1%DMSO作为溶剂对照,正常对照组为未行基因修饰的二代神经干细胞。各组均在常规条件培养箱中培养72h。通过MTT比色法、台盼蓝染色计数及流式细胞仪检测神经干细胞活力和损伤凋亡情况,Western blotting方法检测凋亡相关因子Bax,Bcl-2和Caspase-3的表达。结果:与正常对照组比较,溶媒对照组和基因修饰对照组NSCs活力均显著降低,细胞死亡率及细胞凋亡率均显著增高(P<0.05),而抑凋亡基因Bcl-2蛋白表达下调,促凋亡基因Bax、Caspase-3蛋白表达上调(P<0.05);但基因修饰对照组与溶媒对照组组间比较上述指标无明显差异(P>0.05);与基因修饰对照组比较,TMP实验组呈一定浓度依赖性,能浓度依赖地减少细胞死亡率及凋亡率,增强细胞增殖活性,且TMP可显著上调基因修饰后NSCs中Bcl-2蛋白表达水平,下调Bax、Caspase-3蛋白表达水平,但基因修饰对照组和50、100μg/ml TMP组间无明显统计学差异(P>0.05),200μg/ml TMP组与300μg/ml TMP组间未见明显统计学差异(P>0.05)。结论:TMP能够浓度依赖性地对基因修饰NSCs发挥保护作用,且该作用与其调控凋亡相关因子Bcl-2、Bax及Caspase-3的表达,抑制细胞凋亡有关,这可能是TMP对周围神经系统发挥保护作用的又一相关机制。第二部分 种植神经干细胞的神经组织工程神经桥接物的构建目的:构建复合基因修饰神经干细胞与脱细胞异体神经的桥接物并检测其作为桥接物的形态学特性与免疫原性,为移植修复周围神经缺损提供理想的组织工程桥接体。方法:(1)12只成年健康SD雄性大鼠,切取双侧坐骨神经(共24条),将切取的神经段按下列顺序进行化学处理:①剥除外覆结缔组织,无菌蒸馏水震荡12h。②放入3%TritonX-100中震荡12h后无菌蒸馏水清洗3次。③放入4%脱氧胆酸钠中室温下震荡24h后无菌蒸馏水清洗3次。重复1、3步骤,形成的去细胞神经呈乳白色、半透明样。HE染色、及透射电镜扫描观察化学去细胞神经组织结构。④将化学去细胞神经放入DMEM/F12液中4℃保存备用。(2)取12条脱细胞神经在显微镜下用微量加样器注入10ul基因修饰神经干细胞悬液(1×106/ml)后分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三组,Ⅰ、Ⅱ组各5条,Ⅲ组2条,Ⅰ、Ⅱ两组分别在常规DMEM/F12和有200μg/ml TMP的完全培养基中继续培养,1周后取Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三组各2条切片行HE染色、荧光显微镜与免疫组化染色观察细胞分布与支架结构。(3)另取SD大鼠24只分A、B、C、D4组,每组6只,将保存1周SD大鼠坐骨神经、Ⅰ组组织工程化神经、Ⅱ组组织工程化神经及同种异体SD大鼠坐骨神经分别依次包埋于大鼠皮下,1周后取出各组移植神经行HE染色光镜观察及CD8+和CD4+淋巴细胞侵润情况。结果:脱细胞神经的横切片上可见神经外膜和神经束膜组成的圆形管腔结构,髓鞘及细胞成分基本去除。神经外膜和细胞基底膜均保存较完整。纵切片上可见整齐排列的管道样结构,基本无细胞成分,注射神经干细胞后行纵切片可见神经外膜下和束膜间细胞成份,分布不均。培养1周后两组均有较多增殖与分化神经细胞,基因修饰神经干细胞在去细胞桥神经中生长良好,并且有迁移成行的特性,但Ⅱ组更明显,与Ⅰ组差异有显著性(P<0.05)。皮下包埋后行光镜观察见淋巴细胞浸润依次减少,A、B、C组间均有差异。C、D组间无明显差异。神经内CD4+和CD8+淋巴细胞侵润数A组最多,D组最少,A、B、C组间均有显著差异。C、D组间无明显差异。结论:异体神经化学萃取法可去除神经中的细胞和髓鞘而保留完整的神经基底膜管和纤维支架结构,并且对神经基底膜无明显影响。注射神经干细胞并在含TMP培养基中培养后的组织工程化神经具有正常的三维结构及较低免疫原性,可能会是一种理想的组织工程化人工神经桥接物,作为修复周围神经缺损的桥接物。