恶性肿瘤和癌症一直以来都威胁着人类的生命,使得许多的科学家们都致力于恶性病的研究和防治工作,取得了相当大的成绩。然而目前对于恶性血液病、肿瘤等的治疗方案只对部分病人有效,而治疗失败有可能是多种因素造成的,其中最主要的一个原因是靶细胞对化疗药物的耐受性,是影响化疗疗效的主要障碍。早在二十年前,人们发现,肿瘤细胞一旦对一种化疗药物产生耐药性,通常会对其它结构、功能、作用位点不同的化疗药物也产生抗性,即多药耐药性(multidrug resistance,MDR)。随着对MDR机理的深入了解,越来越多学者把目光投向寻找拮抗或逆转肿瘤细胞MDR。早期研究主要集中在小分子逆转剂逆转肿瘤细胞MDR,如维拉帕米、环孢霉素A、三氟拉嗪等化学增敏剂,现在又有第二、第三代逆转剂相继被发现。但此类药物有明显心、肾毒性,故很少应用于临床。近年来人们转向其它途径寻找逆转肿瘤细胞MDR的有效方法。实验证明,将抗肿瘤药物连结在纳米粒子上,不仅可以提高药物抗癌的功效,抵御多药耐药性,还可以减小药物对正常组织的不良反应,增强药物的选择性。纳米粒子是一种微观胶质体系,其粒径一般<1μm,由纳米微球和纳米微囊构成。纳米微囊是囊性系统,药物分布在囊膜上的独立小孔中。纳米粒子可以穿过组织间隙、毛细血管,通过血脑屏障及组织内皮细胞,将药物在细胞或亚细胞的水平上释放。作为肿瘤药物输送系统,纳米粒子具有缓释药物、靶向输送、减少剂量、保证药效并减轻毒副反应的作用。目前药学中用作药物载体的材料很多,包括脂质体、多糖类、高分子聚合物等。聚氰基丙烯酸烷酯(Polyalkylcyanocraylate, PACA)由于可生物降解及其在外科临床应用中的安全性而成为应用较早也较成熟且具有前景的纳米材料,已报道的有氰基丙烯酸甲酯(MCA)、氰基丙烯酸乙酯(ECA)、氰基丙烯酸正丁酯(BCA)、氰基丙烯酸异丁酯(IBCA)等,随着烷基链的延长,生物降解速度逐渐减慢。经过近30年的发展,证实聚氰基丙烯酸烷酯纳米粒(PACA-NP)较其它纳米载体有较好的被动肝靶向性、制剂的稳定性等诸多优点,经表面修饰后可成为长效制剂,还可制成主动靶向和物理化学靶向制剂。而且证实PACA-NP是目前少数可通过血脑屏障(BBB)的纳米粒之一,甚至空白的PACA-NP还可以与药物起协同作用。还有,PACA-NP是目前唯一被认为有可能对MDR逆转有效的纳米粒载体。植物药紫杉醇(paclitaxel, PTX,商品名Taxol)是具有明显抗肿瘤特性的二萜酰胺类化合物,作为应用于临床的新型药物,目前已成为肺癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈部肿瘤等常见恶性肿瘤的一线用药,其疗效也已在临床实践中得以证实,也是肿瘤晚期仍行之有效的化疗药物。目前,市场上已有注射剂,由于其水溶性差,临床上使用的助溶剂为聚氧乙烯蓖麻油/无水乙醇(50：50)制成的无色黏稠状浓溶液,由此极易导致严重的过敏反应以及肾毒性和神经毒性等不良反应。本课题设想研究设计紫杉醇聚氰基丙烯酸正丁酯(Paclitaxel-loaded polybutylcyanoacrylate nanoparticles, PTX-PBCA-NPs),一方面利用载体包裹脂溶性药物紫杉醇,避免使用聚氧乙烯蓖麻油,降低毒副作用,提高生物利用度。另一方面旨在寻找一种新型的高分子材料作为难溶性抗癌药物给药系统的载体,并能逆转肿瘤MDR现象。基于以上目的,本文主要进行以下几个方面的研究。首先进行PTX-PBCA-NPs处方前研究,包括建立PTX-PBCA-NPs中PTX的HPLC含量测定方法、包封率和载药量测定方法。在此基础上,通过以粒径、分散系数和载药量为评价指标,比较PTX-PBCA-NPs的制备方法,最终确定界面缩聚法优于乳化聚合法(P<0.05)。进行PTX-PBCA-NPs的处方设计和制备工艺研究,以粒径、包封率和载药量为指标,通过对右旋糖酐(Dextran 70)、卵磷脂、PTX用量、BCA单体浓度、有机溶剂的选择、水相的PH值和有机相与水相比例不同进行单因素考察,确定处方；通过正交设计优化处方和制备工艺。制备的PTX-PBCA-NPs(n=3)粒径为(226.93±11.95)nm,包封率为(95.72±0.08)%,载药量为(0.8±0.07)%。对PTX-PBCA-NPs的理化性质进行系统考察,主要包括形态学、稳定性和释放考察等等。结果表明,PTX-PBCA-NPs外观为乳白色液体,质地细腻,色泽均匀,流动性好。通过扫描电镜观察,制得的纳米粒外观圆整,大小较均一,分散性好,其平均粒径在100nm-200 nm范围内,比粒度分析仪测定的结果偏低。粒度分析仪测得PTX-PBCA-NPs的平均粒径在200nm左右,呈单峰分布。将PTX-PBCA-NPs置于4℃冰箱放置,考察其粒径以及载药量的变化。从放样稳定性考察结果可以看出,PTX-PBCA-NPs在4℃条件下,粒径变化不大；但放置1个月后,开始有药物渗漏,载药量降低,放置2个月后,载药量急剧降至原来的一半,其原因可能是被包裹的药物在溶液中扩散所至,说明液体剂型不适于制剂的保存与使用,应将液体剂型冻干。采用动态透析法,以PH 7.4的磷酸盐缓冲液为释放介质,37℃条件下,100 rpm进行体外释药试验；实验表明所制备的NPs具有一定的缓释特点。运用不同的数学模型：Higuchi、Niebergull、Monoexponential、Weibull及Hixcon-Crowell模型对纳米粒的累积释放度数据进行拟合。在本实验中,比较各浓度纳米组的数学拟合模型,以Weibull分布函数拟合度最高(R2=0.926),提示各浓度纳米组能够表现出较为一致的释药行为,所以Weibull模型方程可以最好地拟合本实验的体外释放曲线。进一步观察空白聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的细胞毒性,选用L-02人正常肝细胞、A2780和A2780/T细胞进行毒性实验,以MTT和乳酸脱氢酶(LDH)活性指标考察空白纳米粒的生物相容性。实验表明,用丙酮制备的空白PBCA-NPs在一定范围内对A2780和A2780/T细胞可认为无细胞毒性,但一旦浓度大于304ng/ml,对细胞有明显毒性；用乙醇制备的空白PBCA-NPs浓度大于38ng/ml,对人卵巢癌细胞毒性明显。因此,用丙酮作为溶剂制备的空白PBCA-NPs毒性大于用乙醇制备的。制备的空白PBCA-NPs只有在大于608ng/ml时,对于L-02细胞具有明显的毒性(P<0.05)。而空白PBCA-NPs组对A2780和A2780/T细胞的细胞存活率影响,在浓度304-608ng/ml范围内,与对照组比较均有显著性差异(P<0.05)。为探讨PTX-PBCA-NPs逆转肿瘤多药耐药的机制,采用A2780和A2780/T细胞进行细胞实验。通过RT-PCR实验可知,A2780/T细胞中MDR1基因表达明显高于A2780细胞中MDR1基因表达,有显著性差异(P<0.05)。表明,这两株细胞可用于研究P-gp介导的细胞多药耐药性,为逆转耐药提供依据。药敏实验结果显示,紫杉醇(PTX)溶液作用早期(作用24h),A2780/T细胞显示其药物耐受性,对A2780/T无生长抑制作用。在PTX溶液作用中期与后期(48、72h),A2780细胞较A2780/T细胞更为敏感。而且在一定剂量范围内(3.125-400μg/ml),随着PTX药物剂量的增加和时间延长,A2780细胞和A2780/T细胞抑存活率均逐渐降低,具有剂量和时间依赖性；得到A2780/T细胞对PTX耐药指数在48h时达到149倍,在72h时达到304倍。通过细胞毒实验可知,PTX-PBCA-NPs与同一浓度的PTX原料药相比,对A2780的细胞存活率明显降低。当PTX浓度在9.5-608ng/ml之间时,差异显著(P<0.05)。因此,排除纳米材料毒性,在9.5-152ng/ml之间时,PTX-PBCA-NPs抑制A2780细胞增殖效果显著高于PTX溶液组。而对于A2780/T细胞的结果表明,当PTX浓度在38-608 ng/ml之间时,PTX-PBCA-NPs与同一浓度的PTX原料药相比,对细胞存活率明显降低,有显著性差异(P<0.05)。因此,排除纳米材料毒性,在38-76 ng/ml之间时,PTX-PBCA-NPs抑制A2780/T细胞增殖效果显著高于PTX溶液组。由细胞毒实验结果计算出的数据表明,对于A2780和A2780/T细胞,PTX-PBCA-NPs较PTX溶液毒性明显增强(P<0.05)。因此,PTX-PBCA-NPs在低浓度(38-76ng/ml)时,对A2780/T细胞的抑制作用大于对A2780细胞的；而且PTX-PBCA-NPs比同一浓度的PTX溶液对细胞具有更强的杀伤力。综上所述,本课题采用界面缩聚法制备的PTX-PBCA-NPs粒径大小、分布合适,电镜下观察为圆形,均一性较好。由于PTX水溶性差,载药量不是很高。体外释药研究证实制备的PTX-PBCA-NPs具有一定的缓释特性并符合Weibull模型。细胞毒性实验表明,制备的空白PBCA-NPs只有在大于608ig/ml时,对于L-02细胞具有明显的毒性；而在浓度304-608ng/ml范围内,空白PBCA-NPs组对A2780和A2780/T细胞具有明显毒性。还有,PTX-PBCA-NPs在低浓度(38-76 ng/ml)时,对A2780/T细胞的抑制作用大于对A2780细胞；而且PTX-PBCA-NPs对细胞杀伤能力大于同一浓度的PTX溶液。