原发性肝癌是一种进展迅速,预后很差的恶性肿瘤,其中约90%是肝细胞癌(以下称肝癌,hepatocellular carcinoma, HCC),在世界范围内是第3位癌症死因,在中国是第2位癌症死因,60%-80%的就诊患者均为中晚期,仅能接受姑息性治疗,而且肝癌无敏感化疗药物,更容易出现治疗后复发与转移,严重影响患者预后。因此,肝癌的免疫生物学治疗(immunotherapy)被认为是治疗肝癌的有效手段,将为改善预后发挥重要作用。免疫治疗是通过人为方式对肿瘤患者的免疫系统进行主动或者被动干预,调动机体的免疫系统发挥对肿瘤的免疫反应,清除肿瘤细胞从而实现治疗目的。在HCC中,免疫治疗具有较好的治疗效果,其中,以SLC (secondary lymphoid-tissue chemokine, SLC/CCL21)为基础的免疫治疗显示出很好的抗肿瘤效应。SLC是由内皮细胞,成纤维细胞,活化的T细胞等分泌的趋化因子,通过与趋化因子受体CCR7结合,引起细胞发生迁移等变化,对树突状细胞(dendritic cells,DCs),T细胞等各种免疫细胞的趋化与归巢发挥了重要作用。在HCC荷瘤小鼠的肿瘤局部高表达SLC,肿瘤内CD4+, CD8+T细胞和DCs大量浸润,肿瘤生长得到明显抑制。在SLC趋化募集的免疫细胞中,调节性T细胞(regulatory T cells, Tregs)和DCs对HCC免疫微环境具有关键作用。Tregs是HCC免疫微环境中发挥免疫抑制的关键细胞,由不同亚群构成,其中最主要的是CD4+CD25+Foxp3+的T细胞亚群。Tregs激活后,可以通过与其他免疫细胞直接接触或者以通过分泌抑制性细胞因子,对其他免疫细胞发挥抑制作用,维持肿瘤内免疫抑制微环境。在HCC患者外周血,肿瘤组织及癌旁组织Tregs数量明显上升,并且抑制功能增强,与临床预后呈显著的负相关；以anti-CD25单克隆抗体输注,减少Tregs数量后,肿瘤特异性的CD4+和CD8+T细胞激活则明显提高,取得了较好的抗肿瘤效应,表明减少HCC的Tregs是改善HCC环境中免疫抑制的重要途径。SLC-CCR7信号对Tregs的趋化作用是其在体内发挥功能的重要前提,此外,CCR7信号激活还能明显影响T细胞的其他功能。CCR7信号激活,可以阻止T细胞增殖,保护T细胞抵抗凋亡；更关键的是,CCR7可以作为重要的共刺激信号,辅助CD4+T细胞激活及分泌IL-2和IL-4。因此,CCR7在Tregs中也很有可能作为共刺激分子,产生共刺激信号,影响Tregs的功能。而Tregs功能本身则受到Foxp3-microRNAs (Foxp3-miRNAs)网络的密切调控,所以,SLC-CCR7提供的共刺激信号极有可能在Tregs中协同Foxp3-miRNAs网络,调节Tregs抑制功能。DCs由骨髓来源的前体细胞分化成熟,可以分为髓样DCs (myeloid DCs)和淋巴样DCs (plasmacytoid DCs),是最重要的抗原递呈细胞,在免疫应答的启动过程中发挥了关键作用,其功能状态很大程度上决定了免疫应答的最终效应。肝癌免疫微环境中的成熟DCs数量减少,不成熟DCs数量增加,是诱导并维持HCC免疫耐受的重要因素。DCs数量及功能改变,显著影响HCC患者的预后。SLC则对DCs成熟及功能具有明显影响,在体外培养的DCs中加入SLC,可以有效诱导DCs成熟和增殖,伴随增强的抗原递呈能力；同时,在肿瘤组织高表达SLC同样能诱导瘤内DCs成熟。因此,SLC介导的抗肿瘤效应与其诱导DCs成熟与增殖密不可分。然而,SLC-CCR7诱导DCs成熟与增殖的分子机制尚不清楚。为了进一步探索在HCC中以SLC为基础的免疫治疗方案,提高治疗效果,并从分子水平阐明SLC-CCR7信号轴对Tregs和DCs的作用机制,本课题将从以下三个方面进行研究：1、在HCC瘤内注射SLC并联合anti-CD25 mAbs,检验该治疗方案其是否可以发挥更好的抗肿瘤效应；2、以Hepa 1-6肝细胞癌致敏的Tregs分析SLC-CCR7信号轴与Foxp3-miRNAs网络的关系及其对Tregs的影响；3、以体外实验分析SLC-CCR7信号轴促进DCs成熟与增殖的分子机制。主要研究方法和内容1.采用瘤内注射SLC并联合anti-CD25 mAbs对Hepa 1-6皮下荷瘤小鼠进行治疗,以免疫组化和流式细胞术分析治疗后瘤内Tregs, CD4+T细胞,CD8+T细胞和CDllc+DCs动态变化,采用ELISA检测治疗后第5天瘤内细胞因子IL-10,TGF-β1, IFN-γ及IL-12含量。2.采用免疫组化和流式细胞术动态分析不同治疗组外周淋巴结,脾和肝组织内Tregs, CD4+ T细胞,CD8+T细胞数量变化,以肿瘤体积和质量的变化曲线作为指标分析治疗效果。3.免疫磁珠分选Hepa 1-6致敏的Tregs,流式细胞术对Tregs纯度检验,然后以小鼠miRCURYTM LNA Array ((v.16.0)芯片检测,以火山图(volcano plots)方法筛选差异表达的miRNAs,荧光定量PCR验证,随后以HCC患者外周血Tregs进行独立验证,确定HCC致敏的Tregs中差异表达的miNRAs。4.体外培养Hepa 1-6致敏的Tregs/对照Tregs,转染化学合成的小干扰RNA对Foxp3进行沉默,转染48小时后以荧光定量PCR和流式细胞术对干扰效率进行监测,结合microRNAs芯片分析干扰前后显著变化的miRNAs,寻找Foxp3特异性调节的miNRAs。5.采用TargetScan Mouse对Tregs差异表达miRNAs的靶基因进行预测,以生物信息学软件EGAN分析Foxp3-miRNAs网络与SLC-CCR7信号轴是否存在串话,结合GEO芯片数据库以基因集富集分析(GSEA)方法对可能存在的串话进行检验。6.体外培养BMDCs,以SLC/ELC刺激12,24小时,结合小鼠G Protein-coupled Receptors Signaling PathwayFinder Gene Array芯片基因分析下游显著激活的信号通路,并以Western blot进行验证,探讨CCR7信号诱导BMDCs成熟和增殖的分子机制。主要结果1.瘤内注射治疗后,SLC显著降低瘤内Tregs数量,SLC和anti-CD25联合应用进一步减少Tregs,使其始终维持在最低水平。治疗后第5天,治疗组瘤内CD4+,CD8+T细胞和CD1 1c+DCs数量显著增加,anti-CD25 mAbs协同SLC进一步增加CD8+T细胞的数量；SLC组瘤内的IL-12含量明显增加,IL-10和TGF-β1明显减少,anti-CD25 mAbs能够与SLC发挥有效协同作用,使IFN-γ发生显著增加。2.治疗组淋巴结内Tregs含量显著低于Control组;联合anti-CD25 mAbs进一步显著降低Tregs含量(第7、9天)。治疗后第3天起,治疗组CD8+和CD4+T细胞数量更高；anti-CD25 mAbs能够显著增加CD8+T细胞数量(第3、5天)及CD4+T细胞数量(第5天)。3.治疗组脾组织内Tregs数量显著低于Control组,SLC联合anti-CD25 mAbs使Tregs数量维持最低(第3-9天)。SLC显著增加CD8+T细胞数量(第5、7、9天),anti-CD25 mAbs进一步发挥显著协同作用。SLC联合anti-CD25 mAbs组显著增加CD4+T细胞,SLC组仅在第5,7,9天显著增加CD4+T细胞。4.治疗后肝组织内,治疗组Tregs数量低于Control组,CD8+和CD4+T细胞数量高于Control组。SLC组有显著增加的CD8+T细胞数量,联合anti-CD25 mAbs进一步增加CD8+T细胞数量(第1、3、9天)。Control组CD4+T细胞数量始终处于最低水平,SLC组始终处于最高。5. Control组肿瘤体积持续快速增长,SLC可明显抑制肿瘤增长,anti-CD25 mAbs在治疗后第5天开始发挥有效协同效应,增强SLC抑制作用。Control组肿瘤重量持续快速增加,SLC显著抑制肿瘤生长(第7、9天),SLC联合anti-CD25从治疗后第3天起显著抑制肿瘤生长。6. Hepal-6致敏的Tregs中5个miRNAs明显上调(mmu-miR-487b-5p, mmu-miR-709, mmu-miR-182-5p, mmu-miR-214-3p和mmu-miR-467a-3p),4个miRNAs明显下调(mmu-miR-142-5p, mmu-miR-30b-5p, mmu-miR-409-3p和mmu-miR-129-5p),其中Foxp3干扰后mmu-miR-214-3p, mmu-miR-30b-5p显著下调,mmu-miR-409-3p显著上调；HCC患者外周血Tregs中,hsa-miR-182-5p, hsa-miR-214-3p, hsa-miR-129-5p和hsa-miR-30b-5p显著上调。7. SLC-CCR7下游信号蛋白与调节IL-10, TGF-p1, IFN-γ及IL-12的基因集有明显的关联。基因集富集分析(GSEA)证明调节TGF-β1和IL-10的基因在肿瘤致敏的Tregs显著富集；Foxp3-miRNAs网络与SLC-CCR7信号轴存在串话,调节IL-10, TGF-β1, IFN-γ及IL-12。8. SLC/ELC刺激12、24小时,BMDCs核内磷酸化p65维持在较高水平并且伴随胞浆p65持续低水平,但ELC的效应远远低于SLC, PDTC可以完全阻滞SLC/ELC诱导p65磷酸化；Cyclin D1, E1, E2和p21的表达在刺激后持续维持在较高水平,E2F-1和E2F-2表达没有显著差异。结论1.HCC瘤内注射SLC并联合anti-CD25 mAbs可以有效改善肿瘤免疫微环境,减少其中Tregs数量,降低IL-10和TGF-β1水平,增加CD8+, CD4+T细胞数量和CD11c+DCs,提高IFN-y及IL-12水平；同时可以对宿主淋巴结、脾和肝这些外周免疫器官产生系统性优化,减少Tregs数量,优化CD8+, CD4+T细胞数量,能够实现更好抗肿瘤效应。2.HCC致敏的Tregs出现特征性miRNAs表达谱差,9个miRNAs呈现差异性表达,其中4个miRNAs (hsa-miR-182-5p, hsa-miR-214-3p, hsa-miR-129-5p和hsa-miR-30b-5p)在HCC患者外周血Tregs中显著上调；小鼠Tregs中Foxp3特异性调节mmu-miR-214-3p, mmu-miR-30b-5p和mmu-miR-409-3p,所构成的Foxp3-miRNAs网络与SLC-CCR7信号轴存在串话,共同影响IL-10, TGF-p1, IFN-y及IL-12分泌。3. BMDCs中SLC-CCR7信号激活后,NF-kB信号通路活化,NF-kB p65发生磷酸化,介导其成熟；同时,细胞周期蛋白Cyclin D1, Cyclin E1, Cyclin E2和p21显著上调,参与其增殖。