论文部分内容阅读
恒定自然杀伤T(invariant natural killer T,iNKT)细胞是同时具有NK(natural killer,NK)细胞和T细胞特征的独特细胞亚群,具有CD1d限制性,活化后能够分泌大量细胞因子,具有重要的免疫调节作用,是连接固有免疫和适应性免疫之间的桥梁。现有研究表明,iNKT细胞在人体肝脏中相对富集,可调控乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染后肝内免疫微环境,从而影响HBV感染后疾病的转归。然而,现有研究对于iNKT细胞在HBV感染中的细胞数量与细胞因子分泌功能变化出现过相互矛盾的报道,人体iNKT细胞在HBV感染过程中的效应尚不明确。本研究通过对不同临床分型的慢性HBV感染患者iNKT细胞数量与细胞因子分泌功能的meta分析,结合应用体外混合细胞培养模型,分析人iNKT细胞在HBV感染与非感染细胞刺激状态下的细胞因子分泌差异,并通过RNA-seq分析及公共数据集分析探讨基于感染细胞转录组相关机制。论文共分为两部分,其主要内容与结果如下:一、不同临床分型慢性HBV感染患者iNKT数量与细胞因子分泌功能变化的meta分析:系统搜索PubMed,Embase,Cochrane,Cnki和WanfangData等数据库,选择包含慢性HBV感染患者外周血或肝组织iNKT数量与细胞因子分泌功能变化的研究,进行meta分析。结果显示,外周血iNKT占CD3~+T的比例在不同临床分型的慢性HBV感染患者中呈现动态变化。在慢性HBV携带者(多为免疫耐受患者)中升高,其统计学指标为:与健康对照相比均值差(mean difference,MD)为0.16%,95%置信区间(confidential interval,CI)为[0.10%,0.23%],I~2=0%,p<0.00001。在慢性乙型肝炎患者(包括免疫清除期患者)、非活动性HBsAg携带者(又称非活动性携带者)和乙型肝炎肝硬化患者中均有不同程度的下降(与健康对照相比,慢性乙型肝炎患者MD=-0.10%,95%CI[-0.15%,-0.06%],I~2=42%,p<0.00001;慢性乙肝患者中免疫清除期患者MD=-0.14%,95%CI[-0.20%,-0.09%],I~2=0%,p<0.00001;非活动性HBsAg携带者MD=-0.05%,95%CI[-0.09%,-0.02%],I~2=0%,p=0.004;乙型肝炎肝硬化患者MD=-0.07%,95%CI[-0.09%,-0.04%],I~2=0%,p<0.00001)。对不同临床类型患者进行细胞因子分泌能力分析,结果显示:IFN-γ阳性表达的iNKT(IFN-γ~+iNKT)细胞比例在免疫清除期患者中升高(MD=9.40%,95%CI[3.33%,15.46%],I~2=0%,p=0.002),IL-4阳性表达的iNKT(IL-4~+iNKT)细胞比例在乙型肝炎肝硬化患者中升高(MD=8.88%,95%CI[3.94%,13.82%],I~2=0%,p=0.0004),提示IFN-γ~+iNKT细胞促进抗病毒免疫应答,IL-4~+iNKT细胞促进肝硬化的发生。二、HBV表达阳性与阴性肝癌细胞系刺激iNKT细胞分泌细胞因子的差异及其转录组学分析与公共数据挖掘:选择iNKT细胞系(转染了iNKT TCR的Jurkat CD8~+细胞株,hiNKT38)和两种表达CD1d的肝癌细胞系(HepG2-tmCD1d细胞、HepG2.2.15-tmCD1d细胞,后者表达HBV)分别作为效应细胞与刺激细胞,共培养24 h后检测培养上清中细胞因子的浓度。结果显示模拟HBV感染的HepG2.2.15-tmCD1d刺激组与对照HepG2-tmCD1d刺激组相比,hiNKT38细胞IFN-γ分泌显著减少。将刺激细胞样本送交转录组测序,结果提示HepG2.2.15-tmCD1d细胞IL-18、IL-12A表达下调。另外,对GEO数据库(高通量基因表达数据库)的两个数据集分析也显示感染HBV的人原代肝细胞的IL-18编码基因下调表达。这些结果提示HBV感染可抑制肝细胞内IL-18、IL-12A的表达量,并导致iNKT细胞IFN-γ分泌减少。本研究的结论和意义:1.慢性HBV感染患者外周血iNKT细胞数量与细胞因子分泌功能变化与临床分型相关,IFN-γ~+iNKT细胞比例和IL-4~+iNKT细胞比例分别与抗病毒免疫应答和肝硬化的发生相关。2.人iNKT细胞系hiNKT38对模拟HBV感染的HepG2.2.15-tmCD1d细胞表现出IFN-γ分泌减少。转录组分析结果提示HBV抑制HepG2.2.15-tmCD1d细胞IL-18、IL-12A基因表达量。来源于GEO数据库(高通量基因表达数据库)的两个数据集的结果也显示感染HBV的人原代肝细胞的IL-18编码基因下调表达。本研究的创新点:本论文对慢性HBV感染中iNKT的数量和功能进行meta分析,通过细胞实验分析hiNKT38对于HBV表达阴阳性的两种肝癌细胞系的差异性细胞因子分泌,研究了在HBV刺激下HepG2.2.15-tmCD1d的差异表达基因,结果提示HBV可能通过抑制HepG2.2.15-tmCD1d细胞IL-18、IL-12A的表达逃避iNKT的免疫攻击。