冠状病毒(Coronavirus，CoV)属于套式病毒目（Nidovirales）冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒亚科，可分为α、β、γ、δ四个属，其中α、β冠状病毒主要感染哺乳动物，γ-冠状病毒主要感染鸟类，δ-冠状病毒既可以感染鸟类，也可以感染哺乳动物。自2003年严重急性呼吸综合征（Severe acute respiratory syndrome，SARS）爆发以来，对冠状病毒的研究受到高度重视。近年来，不断有新的冠状病毒被发现，如2012年出现的中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndromecoronavirus，MERS-CoV)，2014年在美国爆发的猪δ冠状病毒(Porcinedeltacoronavirus，PDCoV);而且，随着环境条件变化或免疫压力等因素的影响，一些老的冠状病毒也发生了变异，导致新的变异毒株出现和流行，如2010年底在我国大流行的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)变异毒株。这些新发与再现的冠状病毒，给人类和动物健康造成构成了巨大威胁，并且造成了巨大的经济损失。　　核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N)是冠状病毒的主要结构蛋白，也是冠状病毒编码蛋白中表达丰度最高的蛋白，在病毒的复制与免疫调节中发挥重要作用。以前的研究发现SARS-CoV、鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus，MHV)的N蛋白具有抑制Ⅰ型干扰素(Interferon，IFN)的功能，但其作用机制不清楚。本研究对可以感染哺乳动物的三个冠状病毒属的代表性病毒，包括PEDV(α-CoV)、SARS-CoV和MHV(β-CoV)、PDCoV（δ-CoV）的N蛋白抑制Ⅰ型IFN产生的机制进行研究。主要研究内容与结果如下:　　1.PEDV N蛋白抑制Ⅰ型干扰素产生的机制　　以PEDV变异毒株AJ1102株的基因组RNA为模板，克隆了N蛋白基因并构建了真核表达质粒，转染细胞后发现超表达N蛋白能显著抑制仙台病毒(Sendai virus，SEV)诱导的IFN-β启动子活性以及IFN-β mRNA和蛋白的表达，而且抑制IFN信号通路中关键转录因子IRF3以及NF-κB中的激活，提示PEDV蛋白具有拮抗IFN-β产生的特性。进一步分析了诱导IFN产生的RLR(RIG-Ⅰ-like receptor)通路中的信号分子（RIG-Ⅰ、MDA5、IPS-1、TRAF3、TBK1、IKKε、IRF3等）对N蛋白拮抗IFN-β产生的影响，发现PEDV N蛋白能抑制TBK1/IKKε及其上游分子介导的IFN-β产生，但不抑制IRF3诱导的IFN-β产生，推测PEDVN蛋白可能作用于RLR信号通路中的TBK1/IKKε或TBK1/IKKε与IRF3之间的信号分子。同时，还分析了PEDVN蛋白与RLR信号通路中各分子的相互作用，发现PEDV N蛋白仅与TBK1/IKKε存在相互作用，提示TBK1/IKKε是PEDVN蛋白的作用靶点。随后的研究证实，PEDV N蛋白通过与TBK1结合，导致TBK1与IRF3的结合能力降低，从而阻碍IRF3的磷酸化和核转运，最终导致IFN-β的产生受到抑制。　　2.MHV和SARS-CoV N蛋白抑制Ⅰ型干扰素产生的机制　　PEDV属于α-冠状病毒属，而MHV和SARS-CoV属于β-冠状病毒属。为了探讨MHV和SARS-CoV编码的N蛋白是否与PEDVN蛋白采用相同的机制抑制IFN-β产生，分析了MHV和SARS-CoV N蛋白与TBK1/IKKε的相互作用，发现MHV和SARS-CoV的N蛋白均不与TBK1/IKKε相互作用，而且还发现MHV的N蛋白与以前报道的SARS-CoV的N蛋白一样，不抑制RIG-Ⅰ和MDA5介导的IFN-β启动子激活，提示MHV和SARS-CoV的N蛋白可能作用于RIG-Ⅰ/MDA5或其上游的激活分子，与PEDVN蛋白拮抗IFN-β产生的机制完全不同。进一步分析发现，MHV和SARS-CoV的N蛋白均不与RIG-Ⅰ/MDA5存在相互作用，但与对RIG-Ⅰ/MDA5具有激活作用的dsRNA结合蛋白PACT(Protein activator of the interferon-induced proteinkinase)存在相互作用，而且还发现PACT可以激活RIG-Ⅰ和MDA5激活的IFN-β启动子活性，但这种激活均能被MHV和SARS-CoV N蛋白抑制，提示MHV和SARS-CoV的N蛋白可能通过与PACT的相互作用从而抑制RIG-Ⅰ/MDA5的激活。随后的分析发现MHV和SARS-CoV的N蛋白与PACT的相互作用是依赖RNA的，MHV和SARS-CoV的N蛋白与RIG-Ⅰ/MDA5竞争性结合PACT，减弱了PACT与RIG-Ⅰ/MDA5的相互作用，从而抑制了RIG-Ⅰ/MDA5介导的IFN-β产生，是一种完全不同于PEDVN蛋白的作用机制。　　3.PDCoV N蛋白抑制Ⅰ型干扰素产生的机制　　PDCoV属于新确定的δ冠状病毒属，也是目前δ冠状病毒属中唯一成功在体外分离到病毒的δ冠状病毒。由于是一种新发现的冠状病毒，目前对其免疫学特性知之甚少。为了探究PDCoVN蛋白是否也能像其他冠状病毒的N蛋白一样具有拮抗IFN-β产生的特性，我们首先用IFN-β启动子荧光素酶系统、荧光定量RT-PCR以及ELISA等多种方法证实PDCoV N蛋白能够抑制IFN-β产生。进一步的研究发现PDCoV N蛋白不能抑制RIG-Ⅰ/MDA5及其下游信号分子激活的IFN-β启动子活性，但是能抑制SEV激活的RIG-Ⅰ和MDA5活性。免疫共沉淀实验发现，与MHV和SARS-CoVN蛋白不同，PDCoVN蛋白能够与RⅠG-Ⅰ相互作用，且相互作用区域是RIG-Ⅰ与PACT或dsRNA结合的解旋酶结构域(Hel)和C端结构域(CTD)。进一步的分析发现，PDCoV N蛋白与RIG-Ⅰ的相互作用导致RIG-Ⅰ与PACT或ploy(I∶C)的结合能力降低，从而抑制RIG-Ⅰ/MDA5的激活及下游IFN-β产生。更有意义的是，PDCoV N蛋白也是一种RNA结合蛋白，并且与PACT也存在相互作用。但对PDCoVN基因的截短突变分析发现，PDCoVN蛋白抑制IFN-β产生的区域主要是其N端结构域(NTD)，CTD不具有抑制IFN-β产生的功能。深入分析发现NTD主要负责N蛋白的胞浆定位和RIG-Ⅰ结合等功能;而CTD主要负责N蛋白核定位和RNA结合功能，这些特征对PDCoVN蛋白抑制IFN-β产生无益。综合上述研究结果，PDCoVN蛋白拮抗IFN-β主要是通过与RIG-Ⅰ的Hel和CTD结构域结合，导致RIG-Ⅰ识别或结合PACT和dsRNA能力下降，抑制下游信号通路传导，最终抑制IFN-β产生。　　通过对PEDV、MHV、SARS-CoV以及PDCoV的N蛋白拮抗IFN-β产生机制的研究，发现不同冠状病毒属的N蛋白采用不同的策略拮抗Ⅰ型IFN产生，表明冠状病毒调控抗病毒天然免疫的机制十分复杂。