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生理状态下,人们对能引起潜在组织损伤的刺激产生疼痛反应,这对维持机体完整、保证身体健康至关重要。但是,自发性疼痛或对不恰当的刺激产生持续性的疼痛(慢性疼痛)则会严重影响人类的生活质量。据美国科学院医学研究所报道,慢性疼痛的发病率已超过心血管疾病、糖尿病和癌症的发病率,成为天下第一大病。作为最常见、最顽固、最难治的慢性疼痛,神经病理性疼痛因其高发病率、高致残率已经引起人们的密切关注。阐明神经病理性疼痛神经学机制以及寻求有效的治疗手段,是当今医学界亟待攻克的重大课题。神经病理性疼痛是以自发性疼痛(spontaneous pain)、痛觉过敏(hyperagesia)及痛觉超敏(allodynia)为主要临床特征[1]。内源性大麻素系统(endocannabinoid system,ECS)主要由内源性大麻素(endocannabinoids,e CBs)(如AEA、2-AG、OEA等)、作用受体(CB1、CB2、TRPV1等)以及大麻素代谢酶(FAAH、MAGL等)组成[2]。以往研究多报导了内源性大麻素系统在痛觉通路中的镇痛作用[3-6],近年来的一些研究提示其可能通过抑制抑制性中间神经元的功能而发挥致痛作用[7-10]。Starowicz and Przewlocka推测,神经损伤后脊髓背角e CBs的含量升高,以某种形式促进神经病理性疼痛的发生[11]。脊髓星形胶质细胞在慢性疼痛包括炎症痛、神经病理性痛和癌症痛等的发生发展过程中起重要作用[12,13]。已证实星形胶质细胞上存在CB1受体,其可被神经元释放的e CBs激活,引起星形胶质细胞释放谷氨酸,进而激活神经元突触外NMDA受体[14]。外源性大麻素(exogenous cannabinoids)也可激活星形胶质细胞CB1受体,引起谷氨酸释放[15]。本研究拟运用动物行为学、免疫荧光染色等技术,探讨脊髓内源性大麻素含量升高是否会激活星形胶质细胞并参与神经病理性痛觉超敏的形成,为进一步研究神经病理性疼痛的发生机制提供实验依据。第一部分:内源性大麻素受体CB1与脊髓背角星形胶质细胞的共定位目的观察脊髓背角的星形胶质细胞上是否表达内源性大麻素受体CB1。方法选用SPF级雄性C57BL/6小鼠4只,麻醉后先用PBS冲净血液,随即灌入多聚甲醛。取脊髓腰膨大段后固定、蔗糖梯度脱水、冰冻切片后,每只小鼠随机挑取3片脊髓片行GFAP/CB1免疫荧光双标,观察脊髓背角处二者的共标情况。结果脊髓背角处的星形胶质细胞上表达内源性大麻素受体CB1。第二部分:升高鞘内大麻素水平对实验大鼠机械性缩足阈值的影响目的观察鞘内大麻素含量升高后实验大鼠疼痛行为的变化。方法选用SD雄性大鼠36只,随机分为2-AG组(n=6)、乙腈对照组(n=6);CP55940组(n=6)、DMSO溶剂对照组(n=6);JZL195组(n=6)、DMSO溶剂对照组(n=6)。全部行鞘内置管术。利多卡因试验后取造模成功动物进行鞘内给药。分别在给药后第1、3、5、7、14、21 d测量实验大鼠机械性缩足反射阈值。结果与各自溶剂对照组相比,鞘内注射大麻素2-AG、大麻素受体激动剂CP55940、大麻素水解酶抑制剂JZL195后可在第1 d产生明显痛觉超敏(P<0.01)并至少持续到给药后第21 d(P<0.001)。第三部分:升高鞘内大麻素水平对脊髓背角星形胶质细胞的影响目的观察鞘内大麻素含量升高后,实验大鼠脊髓背角处星形胶质细胞的激活状态。方法选用75只SD大鼠,随机选取21只为2-AG实验组、21只为CP55940实验组、21只为JZL195实验组,剩余每组3只作为相应的溶剂对照组。全部行鞘内置管术,利多卡因试验后取造模成功动物进行鞘内给药。分别在给药后第1、3、5、7、14、21 d取大鼠脊髓腰膨大,后固定、脱水、冰冻切片后,每组三只、每只大鼠随机挑取3片脊髓片行GFAP免疫荧光单标,观察脊髓背角处星形胶质细胞激活情况。结果与各自溶剂对照组相比,鞘内注射大麻素2-AG、大麻素受体激动剂CP55940、大麻素水解酶抑制剂JZL195后可在第3 d开始激活星形胶质细胞(P<0.05)并至少持续到给药后第21 d(P<0.01)。第四部分:敲除星形胶质细胞上的CB1受体对实验小鼠疼痛行为及脊髓背角星形胶质细胞的影响目的观察敲除星形胶质细胞上的CB1受体后,神经损伤后实验小鼠机械性缩足阈值的变化以及脊髓背角处星形胶质细胞的激活状态。方法选用雄性GFAP-CB1-KO小鼠、GFAP-CB1-WT小鼠各9只。随机选出3只KO小鼠、3只WT小鼠取脊髓,免疫荧光组织化学染色备用。剩余12只全部行坐骨神经结扎术(CCI模型)。术后第7 d行为学检测完后随机抽取3只KO小鼠、3只WT小鼠取脊髓,免疫荧光组织化学染色备用。术后第14 d行为学检测完后剩余3只KO小鼠、3只WT小鼠取脊髓,免疫荧光组织化学染色备用。结果与WT+CCI小鼠相比,敲除星形胶质细胞上CB1受体的小鼠在神经损伤后未形成明显痛觉超敏(P<0.001);同时,其脊髓背角处星形胶质细胞的激活也明显减少(P<0.01)。小结:1.脊髓背角处的星形胶质细胞上表达大麻素受体CB1。2.升高鞘内大麻素水平可导致实验大鼠产生痛觉超敏。3.升高鞘内大麻素水平可明显激活脊髓背角处星形胶质细胞。4.敲除星形胶质细胞上的CB1受体后,神经损伤未诱发明显痛觉超敏,星形胶质细胞激活也明显减少。结论:神经损伤后脊髓水平内源性大麻素含量升高,通过激活星形胶质细胞上的CB1受体,活化星形胶质细胞,参与痛觉超敏的形成。