水稻（Oryzae sativa）是世界上的主要粮食作物之一，提供了世界上近半数人口的粮食来源。由稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）侵染引起的稻瘟病是一种全球性真菌病害，在不同国家水稻种植区都有不同程度的发生。长期的应用实践表明，培育和利用广谱抗病品种是防控稻瘟病最安全有效和环保的策略。然而，由于稻瘟菌小种复杂易变，抗性品种在种植几年后就逐渐变为感病品种。因此，深入开展稻瘟菌与水稻互作机制研究对创制新的病害防控策略具有重要意义。本实验室前期工作从水稻中克隆了广谱抗性（R）基因Piz-t，随后和合作者从稻瘟菌中克隆了相应的无毒（Avr）基因AvrPiz-t。酵母双杂交实验表明Piz-t与AvrPiz-t不能直接相互作用。为了研究AvrPiz-t-Piz-t介导的抗病分子机制，利用酵母双杂交系统在水稻中鉴定到AvrPiz-t的12个候选靶标蛋白：APIP1-12。其中，APIP4编码一个Bowman-Birk类型的胰蛋白酶抑制剂。本论文深入解析了APIP4介导的稻瘟菌效应蛋白AvrPiz-t和水稻NLR蛋白Piz-t的相互作用机制。
　　首先，运用GST pull-down和免疫共沉淀等方法证明AvrPiz-t与APIP4存在特异的相互作用。生化实验表明，APIP4在体内外均表现出特异性的胰蛋白酶抑制剂活性，而活性位点突变APIP4K198A蛋白部分丧失了胰蛋白酶抑制剂活性。AvrPiz-t与APIP4共表达时，发现AvrPiz-t可以特异性的抑制APIP4的胰蛋白酶抑制剂活性。为了研究APIP4基因的生物学功能，构建了APIP4的敲除和超量表达材料，接种实验表明敲除APIP4的株系降低了对稻瘟菌小种RB22的抗病性，而超量表达APIP4的水稻植株则增强了对RB22的抗病性。因此，APIP4是水稻抗稻瘟病的一个正调控因子。值得注意的是，APIP4的超表达转基因植株增强了胰蛋白酶抑制剂活性。而在水稻中异源表达AvrPiz-t则明显抑制了APIP4的胰蛋白抑制剂活性。与此同时，我们发现Piz-t-HA的转基因植株可以增强APIP4的胰蛋白抑制剂活性，同时也增强了APIP4的转录水平和蛋白积累。GST pull-down、荧光素酶互补实验和免疫共沉淀实验证明，Piz-t能够与APIP4直接相互作用。我们还进一步在Piz-t背景下敲除APIP4，发现敲除材料没有影响Piz-t介导的抗病性，而减弱了对毒性小种的抗病性。以上结果揭示了稻瘟菌效应蛋白AvrPiz-t和水稻中相应的NLR蛋白Piz-t通过拮抗作用共同调节胰蛋白酶抑制剂APIP4的活性，从而调控水稻对稻瘟菌抗性的新机制。