论文部分内容阅读
目的：了解问号钩端螺旋体(简称钩体)感染细胞前后sph2基因表达水平变化,确定鞘磷脂酶类溶血素Sph2诱导人和鼠单核-巨噬细胞、肝细胞凋亡的活性及其机制。
方法：采用实时荧光定量PCR检测问号钩体赖株感染小鼠单核-巨噬细胞J774A.1、小鼠肝细胞IAR20和人肝细胞L-02、人单核-巨噬细胞THP-1后sph2基因mRNA水平变化。采用PCR从黄疸出血群赖型赖株钩体基因组DNA中扩增全长sph2基因片段并构建sph2基因原核表达系统,采用SDS-PAGE检查重组Sph2(rSph2)的表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯rSph2。采用绵羊血平板溶血试验及血红蛋白分光光度法测定rSph2的溶血活性;采用流式细胞术检测重组表达的Sph2(rSph2)诱导J774A.1、IAR20、L-02和THP-1细胞凋亡活性。采用FITC标记rSph2(FITC-rSph2),检测FITC-rSph2内化进入细胞的情况。
结果：问号钩体赖株感染细胞后0.25-2 h,其sph2基因mRNA水平开始上升,最高时可达感染前的4-8倍(P＜0.05),然后逐渐下降。与GenBank中sph2基因比较,所克隆的sph2基因序列相似性为100％。所构建的原核表达系统能高效表达rSph2。rSph2以浓度依赖方式溶解绵羊红细胞。10μg/mL rSph2可诱导J774A.1、IAR20、THP-1和L-02细胞凋亡,凋亡率峰值分别为23.96％、32.92％、17.52％和24.13％。FITC-rSph2与J774A.1、IAR20、THP-1和L-02细胞共孵育15-30 min后即可内化进入细胞内。
结论：问号钩体sph2基因呈宿主细胞接触式瞬时表达,提示其表达产物Sph2鞘磷脂酶类溶血素在问号钩体致病过程中发挥作用。rSph2不仅可损伤单核-巨噬细胞和肝细胞细胞膜,还可诱导上述细胞发生凋亡,故sph2是问号钩体重要的毒力因子,与钩体病时黄疸和肺出血密切相关。rSph2诱导细胞凋亡机制可能与其水解细胞膜鞘磷脂产生神经酰胺、损伤线粒体膜导致多种凋亡或促凋亡因子释放、激活细胞凋亡线粒体和神经酰胺途径有关。