目的:双酚A（Bisphenol A,BPA）主要用于食品饮料容器和食品包装袋等产品的生产过程,是一种人体可普遍暴露的环境内分泌干扰物。BPA能穿过血脑屏障,这使得大脑成为BPA的重要作用靶点。学习记忆能力是一切认知活动的基础。胚胎期、婴幼儿时期及青春期被认为是学习记忆能力形成和巩固的关键时期。研究发现,发育关键期BPA暴露可能通过破坏突触可塑性、干扰神经递质稳态等途径对大脑结构、认知行为及学习记忆等产生不良影响。但是,目前关于BPA对学习记忆能力影响的研究报道仍然较少且具体机制尚不清楚。BPA的结构类似于己烯雌酚（diethylstilbestrol,DES）,可模拟或拮抗雌激素的生物学功能。17β-雌二醇（17β-oestradiol,E2）是体内重要的雌激素,也是一种能调控学习记忆过程的重要神经调质。E2与雌激素受体α（estrogen receptor,ERα）结合后,能迅速激活蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）,进而激活细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）及其下游的转录因子c AMP反应元件结合蛋白（c AMP response element binding protein,CREB）,从而调节学习记忆能力。BPA可作为ERα的激动剂或拮抗剂,干扰E2的生物学作用。因此,研究BPA对E2、ERα及其下游PKC/ERK/CREB信号通路的影响,对探寻BPA对学习记忆影响的机制具有重要意义。然而,BPA的毒性作用机制并非单一的。除了干扰性激素功能外,BPA还可通过诱导氧化应激等途径对机体产生不良影响。突触是学习记忆形成的生理基础。当突触发生氧化应激时,活性氧（reactive oxygen species,ROS）和活性氮（reactive nitrogen species,RNS）的积累可直接破坏突触的膜结构,并影响突触膜上各种蛋白如雌激素受体、神经递质受体N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR）和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑-丙酸受体（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionicacid receptor,AMPAR）、突触结构标志蛋白synapsin I和突触后致密物-95（postsynaptic density protein-95,PSD-95）等的表达和功能。这些受体及结构蛋白在维持突触结构和功能的完整性上具有重要作用。此外,NMDAR的激活可使Ca2+快速内流,激活PKC,进而快速激活PKC/ERK/CREB信号通路,从而调控学习记忆能力。因此,研究突触相关蛋白的改变对探讨BPA致突触氧化损伤作用及机制具有重要意义。目前,BPA诱导海马突触产生氧化应激的具体机制并不清楚。机体产生氧化应激的原因之一是ROS和RNS的来源增多。线粒体是产生ROS的主要场所,线粒体呼吸链复合体I和III是产生O2·-的主要部位。线粒体内ROS的不断积累会导致线粒体功能紊乱进而产生更多ROS,最终使整个细胞发生氧化损伤。此外,神经元型一氧化氮合酶（neuronal NO synthase,nNOS）可在NMDAR激活后催化L-精氨酸产生一氧化氮（NO）。NO不仅是突触传递和可塑性的关键信号分子,更是一种RNS。机体产生氧化应激的另一个重要原因是抗氧化能力降低。Kelch样ECH相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein,keap1）/核因子促红细胞生成素2相关因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）信号通路可调控下游抗氧化酶类（如过氧化物酶和过氧化氢酶等）和解毒酶类（如血红素加氧酶等）的基因和蛋白表达,从而起到抗氧化作用。因此,探讨BPA暴露对线粒体功能、nNOS及keap1/Nrf2信号通路的影响,对揭示BPA暴露致突触氧化损伤的原因和具体机制具有重要意义。目前,拮抗BPA毒性的抗氧化剂主要包括褪黑素、维生素C和E等,且相关研究非常少。α-硫辛酸（α-lipoic acid,ALA）是一种生物硫醇,可以自由地穿过生物膜,它可通过清除ROS和RNS、再生其它内源性抗氧化剂等途经发挥其抗氧化作用。ALA还是线粒体代谢及线粒体内氧化还原调节过程中的重要辅助因子。研究发现,ALA可以改善老年大鼠的空间记忆能力。因此,研究ALA对BPA所致学习记忆能力损伤的保护作用及相关机制,对探寻能拮抗BPA暴露所致神经毒效应的有效抗氧化剂具有重要意义。综上所述,本研究第一部分将探讨发育期BPA暴露对小鼠学习记忆能力的影响及ALA的保护作用;第二部分通过研究海马ERα、突触相关蛋白及PKC/ERK/CREB信号通路的改变来探讨BPA暴露致海马突触损伤的作用机制及ALA的保护机制;第三部分通过研究线粒体功能、nNOS及keap1/Nrf2信号通路的改变,从氧化应激的角度探讨BPA暴露致海马突触损伤的具体机制及ALA的保护机制。本研究通过上述三部分为进一步阐明BPA暴露的神经毒性作用及机制提供新的理论依据,也为探寻拮抗BPA暴露所致神经毒效应的有效抗氧化剂提供参考依据。研究方法:1.动物实验:4周龄C57BL/6J雌性小鼠50只,适应性喂养一周后随机分为5组（10只/组）:对照（control）组、0.1μg/m L BPA（0.1 BPA）组、0.2μg/m L BPA（0.2 BPA）组、0.6 mg/m L ALA（ALA）组和0.2μg/m L BPA+0.6mg/m L ALA（0.2 BPA+ALA）组。BPA及ALA通过饮水方式暴露8周。记录小鼠的体重、摄食量和饮水量。采用Morris水迷宫实验、新位置和新物体识别实验及穿梭箱实验检测小鼠学习记忆能力。采用ELISA检测小鼠海马Ach和GABA水平、血清E2水平、血清及海马中8-OHd G水平;采用试剂盒检测小鼠血清及海马中MDA水平、CAT酶活性及SOD酶活性;采用HE染色检测小鼠海马组织病理学改变;采用免疫组化检测海马组织中ERα、NR2B、Glu A1、PSD-95、synapsin I及Nrf2的蛋白表达水平;采用Western blot检测海马组织中ERα、突触相关蛋白、PKC/ERK/CREB信号通路、nNOS及keap1/Nrf2信号通路相关蛋白表达水平。2.细胞实验:本实验采用小鼠海马神经元细胞系HT-22细胞,在BPA和ALA暴露同时,添加Nrf2抑制剂,进一步研究BPA暴露导致的氧化应激及ALA的保护作用是否与Nrf2有关。根据不同的实验目的,将细胞分为五组和六组。（1）五组:对照（control）组,50μM BPA组,100μM BPA组,150μM ALA组,以及100μM BPA+ALA组,染毒时间为24 h。（2）六组:对照（control）组,100μM BPA组,150μM ALA组,BPA+ALA组,50 n M鸦胆子苦醇（Brusatol,BT,Nrf2特异性抑制剂）组,以及BPA+ALA+BT组,染毒时间为24 h。采用CCK-8检测细胞活力并确定BPA、ALA及BT的染毒剂量;采用流式细胞仪检测细胞中ROS水平;采用试剂盒检测细胞中线粒体复合体I和III的酶活力及细胞ATP水平;采用Western blot检测HT-22细胞中ERα、突触相关蛋白、PKC/ERK/CREB信号通路、nNOS及keap1/Nrf2信号通路相关蛋白表达水平。结果:1.与对照组相比,BPA暴露组小鼠在第3-5天找到平台的逃避距离和逃避潜伏期增加,在第6天小鼠进入目标象限的频率下降、潜伏期延长、累计时间减少;与0.2 BPA组相比,0.2 BPA+ALA组小鼠的上述指标均有所改善。与对照组相比,BPA暴露组小鼠对新位置和新物体的识别指数显著降低;与0.2 BPA组相比,0.2 BPA+ALA组小鼠的识别指数显著升高。与对照组相比,BPA暴露组小鼠的主动逃避反应频率和时间降低,被动逃避反应频率和时间升高;与0.2BPA组相比,0.2 BPA+ALA组小鼠的上述指标均有所改善。各组间小鼠体重、脑重、海马重及脑组织系数均无统计学差异;0.2 BPA组小鼠的海马组织系数显著低于其他组。与对照组相比,BPA暴露组小鼠海马CA1区神经元层数减少、形态改变、边界不清、核固缩且神经元数量减少,DG区神经元核固缩但数量不变;与0.2 BPA组相比,0.2 BPA+ALA组小鼠海马的上述病理学改变有所改善。2.与对照组相比,BPA暴露组小鼠海马组织中Ach和GABA的水平、血清中E2水平均降低;与0.2 BPA组相比,0.2 BPA+ALA组小鼠Ach、GABA及E2水平升高。与对照组相比,BPA暴露组小鼠海马组织及BPA暴露的HT-22细胞中,ERα、p-NR2B、NR2B、p-Glu A1、Glu A1、PSD-95及synapsin I的蛋白水平均降低;ALA能在一定程度上缓解上述蛋白表达水平的降低。与对照组相比,BPA暴露组小鼠海马组织中PKC、PKCα、PKCε、p-ERK、p-CREB和CREB的蛋白水平均降低;与对照组相比,BPA暴露的HT-22细胞中PKCα、PKCε、p-ERK、ERK、p-CREB和CREB的蛋白水平均降低;ALA能缓解BPA所致海马组织及HT-22细胞中上述蛋白表达水平的降低。3.在动物实验及细胞实验（五组）中,与对照组相比,BPA暴露组小鼠血清和海马组织中MDA和8-OHd G的水平升高、CAT和各型SOD的酶活力降低;与0.2 BPA组相比,0.2 BPA+ALA组小鼠血清和海马组织中上述指标均有所改善。与对照组相比,BPA暴露的HT-22细胞中ROS水平升高、线粒体复合体I和III的酶活力下降、细胞内ATP水平降低;与100μM BPA组相比,100μM BPA+ALA组HT-22细胞中上述指标均有所改善。与对照组相比,BPA暴露组小鼠海马组织及HT-22细胞中nNOS的蛋白表达水平升高,海马组织中Nrf2、HO-1和NQO1及HT-22细胞中keap1、Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表达水平均降低;ALA能改善BPA所致海马组织及HT-22细胞中上述蛋白表达水平的改变。4.在细胞实验（六组）中,与对照组相比,BPA暴露的HT-22细胞中ROS水平升高,keap1、Nrf2、HO-1、NQO1、ERα、p-NR2B、NR2B、p-Glu A1、Glu A1、PSD-95、synapsin I、PKCα、PKCε、p-ERK、ERK、p-CREB和CREB的蛋白表达水平均降低;与100μM BPA组相比,BPA+ALA组细胞ROS水平降低,上述蛋白表达水平升高;与BPA+ALA组相比,BPA+ALA+BT组细胞ROS水平升高,上述蛋白表达水平降低。结论:1.BPA暴露可损伤小鼠学习记忆能力,其机制与BPA暴露降低E2水平、下调ERα和突触相关蛋白表达进而抑制PKC/ERK/CREB信号通路有关。2.BPA暴露可降低线粒体功能、上调nNOS表达、抑制keap1/Nrf2信号通路导致海马氧化损伤,这可能是BPA暴露降低ERα和突触相关蛋白表达,损伤突触结构功能的重要病理机制之一。3.ALA可拮抗BPA暴露对学习记忆能力的损伤作用,其机制与ALA激活keap1/Nrf2信号通路增加抗氧化酶的表达和活性、降低ROS水平,从而抑制氧化应激对海马突触ERα和突触相关蛋白的氧化损伤有关。