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新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是严重危害养禽业的烈性传染病——新城疫(Newcastle disease,ND)的病原。由于V4和1-2等耐热ND弱毒疫苗的贮存和运输不需要依赖冷链,在热带、亚热带国家和地区已经得到广泛应用。我国上世纪90年代引进了 NDV耐热毒株V4,但由于知识产权等的限制,至今未大规模应用于生产。本研究从保存的40多株NDV中筛选到1个耐热强毒株(HR09株);测定了该毒株的全基因组序列,并分析了其分子生物学特性;建立了该毒株的反向遗传操作系统,并对其F基因进行突变,得到NDV耐热弱毒株。本研究为进一步揭示NDV耐热毒株的耐热机制和创制耐热ND弱毒疫苗奠定了基础。1新城疫病毒耐热株HR09鉴定及全基因组序列测定将本室保存的40多个NDV分离株与V4、LaSota等参考毒株共同进行耐热性试验。以56℃耐热处理30 min时仍具有血凝性作为筛选标准,获得1个耐热毒株——HR09株。HR09株经蚀斑纯化后进行生物学特性鉴定,显示该毒株的MDT为57.6 h,ICPI为1.8,IVPI为1.56,符合NDV强毒株特征。设计10对引物,对HR09株全基因组序列进行扩增、测定和生物信息学分析,结果显示,该毒株基因组全长为15192 nt,推导的F蛋白裂解位点氨基酸序列为112RRQKRF117,HN蛋白长度为571个氨基酸残基,符合NDV强毒株特征。HR09株基因组GC含量为46.27%,与耐热的V4株、1-2株全基因组的核苷酸序列同源性为86.7%和85.4%,6个结构蛋白编码基因的核苷酸序列同源性介于83.1%～95.6%之间、推导的氨基酸序列同源性介于81.6%～98.0%之间。基于F基因全长所构建的进化树显示,HR09株属于基因ⅷ型毒株。2新城疫病毒耐热株HR09反向遗传操作系统的构建设计了多对引物,构建了 HR09株基因组的全长cDNA克隆以及含有该毒株NP、P和L基因的3个真核表达质粒,共转染BSR-T7/5细胞,拯救出病毒NDV/rHR09。对获救病毒的耐热性进行测定,显示其经56℃处理60 min时仍具有血凝活性,说明NDV/rHR09株与亲本株的耐热性相似。NDV/rHR09株的MDT值为60 h,ICPI值为1.625,仍为NDV强毒株。3新城疫病毒耐热弱毒株rAHR09的构建设计两对引物,经Overlap PCR的方法将NDV/rHR09毒株F基因裂解位点的112、115和117位碱性氨基酸突变成弱毒株特征的非碱性氨基酸,构建了转录载体prNDV/HR09,将转录载体与NP、P和L基因的真核表达质粒共转染BSR-T7/5细胞,拯救出病毒NDV/rAHR09。经56。C、45min处理,NDV/rAHR09株仍具有血凝性,MDT值>120h,ICPI值为0.057。结果表明,NDV/rAHR09株具有耐热性,且毒力已明显致弱,可以作为耐热ND弱毒疫苗的候选毒株。