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发菜是一种陆生固氮蓝藻,主要分布于干旱、半干旱荒漠草原地区,是当地主要的生物固氮资源和拓荒植物。固氮酶由固氮基因nif矿编码,在钼铁固氮酶系统中,nifH基因编码铁蛋白,nifD基因和nifK基因编码钼铁蛋白。本研究通过qRT-PCR技术,分析不同干旱胁迫下发菜固氮酶基因nifH、nifD、nifK在转录水平的表达变化；根据同源物种设计简并性和特异性引物,克隆nifH、 nifD、nifK基因全长,研究其原核表达并进行生物信息学分析。结果表明：(1)发菜固氮酶nifH、nifD和nifK基因随藻体含水量的逐渐降低,基因在转录水平上的表达量呈逐渐增加；(2)根据简并性引物和特异性引物克隆获得长度为894 bp的nifH基因,GenBank登陆号为Banklt1901364 (KU886163);1443 bp的nifD基因,GenBank登陆号为BankIt1901385(KU886164)；1536 bp的nifK基因, GenBank登陆号为BankIt1901391 (KU886165);(3)将nifH、nifD和nifK基因在大肠杆菌中表达,分别获得一个约36kD、57 kD、和58 kD的外源蛋白；(4)生物信息学分析表明：①nifH、nifD和nifK核苷酸序列和氨基酸序列均具有较高的保守性；②nifH在第240位的丙氨酸亲水性最强,第273位的谷氨酸疏水性最强：nifD在第28位的赖氨酸亲水性最强,第359位的蛋氨酸疏水性最强；nifK在第51位的酪氨酸亲水性最强,第76位的苯丙氨酸疏水性最强；③nifH蛋白的Ser有4个磷酸化位点、Thr有3个磷酸化位点和Tys有2个磷酸化位点；nifD蛋白的Ser有12个磷酸化位点,Thr有10个磷酸化位点,Tys有6个磷酸化位点；nifK蛋白的Ser有15个磷酸化位点,Thr有8个磷酸化位点,Tys有6个磷酸化位点。④nifH、nifD和nifK蛋白均为膜外蛋白。nifH、nifD、nifK基因编码的蛋白,二级结构主要由a螺旋、随机卷曲、折叠和转角构成。三级结构预测结果,nifH、nifD、nifK序列与数据库中X晶体衍射结构相似度分别为52%、70%和55%。研究结果为进一步研究发菜固氮酶基因的分子结构和发菜响应干旱胁迫的固氮机理及氮代谢过程奠定了基础。