背景与目的大脑的是高血流量、高耗氧量的器官,脑的重量仅占体重的2%,血流量却占心输出量的15%左右,耗氧量约占全身耗氧量的20%。但同时,大脑的能源储备极少,几乎只能利用脑循环提供的氧和葡萄糖进行有氧代谢,对脑循环有高度的依赖性。一旦发生完全性缺血缺氧超过5分钟,脑细胞就会发生不可逆性死亡,所以脑循环功能的正常意义重大,尤其是在急性脑梗死等缺血缺氧条件下,脑循环功能决定了脑部病变的发展和转归。脑循环是一个高度专业化的血管床,脑血管内皮细胞在脑循环的调节中起着重要的作用。脑血管内皮细胞在一些病理情况下如缺血缺氧时,经常会受到损伤,我们以往对脑缺血缺氧的研究都主要集中在神经元、神经胶质细胞、神经干细胞等方面,对脑血管内皮细胞的研究不多。除了常见的脑血管病以外,许多脑部疾病均伴发有缺血缺氧,所以研究脑血管内皮细胞缺血缺氧时的功能改变及其机制有重要的临床意义。缺氧时,脑血管内皮细胞的功能改变主要为：以增殖、凋亡、自噬等为表现的细胞生存改变和内分泌变化,而生存改变是基础,所以本实验主要研究缺氧时血管内皮细胞的增殖、凋亡和自噬的变化,并探讨其机制。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)是代谢的感应器,哺乳动物AMPK是由三个亚基组成的异三聚体复合体,包括α亚基、p调控亚基和γ亚基。a催化亚基含有一个高度保守的丝氨酸苏氨酸激酶结构域,靠近活化环的N-末端,Thr-172磷酸化对酶的活性起关键作用；p亚基没有催化活性,可能与细胞内AMPKαβγ复杂体装配和细胞传感糖原相关；γ亚基通过感知细胞内ATP、ADP和AMP的浓度调节酶的活性。通过激活AMPK保持能量的平衡代谢途径(ATP生产)和抑制合成代谢途径(ATP消耗)。AMPK在营养条件差条件下激活,而营养丰富的条件下失去活性。AMPK激活下游的效应包括脂质和糖代谢、能量消耗、免疫反应、细胞生长和极性。AMPK广泛存在于人体多种组织,但在脑血管内皮细胞的研究不多。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin, mTOR)是调节细胞生长的一种丝氨酸苏氨酸激酶。在AMPK激活后mTOR活性抑制。mTOR活化都需要来自营养成分(葡萄糖,氨基酸)和生长因子的积极信号。在哺乳动物中,mTORC1复合物(mTOR complex 1, mTORC1)是由四个已知亚基构成：Raptor、PRAS40、mLST8和mTOR。mTORC1对营养信号敏感,可被细菌的大环内酯类雷帕霉素很快抑制,控制细胞的生长、血管生成及代谢。相反,mTORC2对营养信号是不敏感的,也不能被雷帕霉素很快抑制。mTORC1的两个已知底物是4EBP1和p70核糖体S6激酶。除了这些生长刺激信号激活]mTORC1,复合体可通过各种细胞应激迅速失活,从而保证细胞不受损害。mTORC1复合体的一个独特的方面是,它是依赖于养分利用而表现激酶活性。在低氧气条件下,细胞激活一系列关键通路而适应生存,其中大多数途径的是由转录因子缺氧诱导因子1(Hypoxia inducible factor 1,HIF-1)调节的,这在很大程度上依赖于细胞利用氧的能力作为信号来控制]HIF-1α的稳定性和转录活性。活化的HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β两亚基组成构成异源二聚体,HIF-1α受氧浓度的精密调节且不稳定,亚基与氧水平无关。HIF-1β是乏氧诱导反应HIF-1α的关键分子,乏氧条件下,它被诱导表达。以前的研究证明在神经系统发挥重要作用,但在脑血管内皮细胞的作AMPK用还知之甚少,本课题我们将用分离的小鼠脑血管内皮细胞研究乏氧条件下在脑血管内皮细胞的功能,包括脑血管内皮细胞的增殖和凋亡,并研究其AMPK功能是否通过HIF-1进行的。自噬是细胞维持其细胞稳态的一个重要机制,我们将研究在脑血管内皮细胞自噬中的作用及机制。AMPK-mTOR第一部分乏氧条件-下在脑血管内皮细胞增殖及介导线粒体途AMPK径凋亡中的作用目的：研究脑血管内细胞在乏氧条件下表达的情况。明确HIF-1是否AMPK参与了乏氧条件下的活化。研究乏氧条件下AMPK对血管内皮细胞增殖、AMPK凋亡的作用及机制。方法：首先分离出小鼠脑血管内皮细胞(Cerebrovascular endothelial cells, CVEC),然后将其在乏氧(1%02)和常氧条件下进行培养,分别观察乏氧0、4、12和24小时的MPK表达,用Real time PCR法检测AMPK的表达。为明确HIF-1是否参与了乏氧条件下AMPK的活化,我们将小鼠血管内皮细胞在乏氧条件下培养,并用HIF-1α抑制剂处理细胞,检测细胞的AMPK活性。研究AMPK在脑血管内皮细胞中的增殖和凋亡的作用,用MTT法检测血管内皮细胞在乏氧条件下的增殖,并用AMPK shRNA及AMPK抑制剂下调AMPK后观察血管内皮细胞的增殖。用流式细胞仪检测乏氧条件下血管内皮细胞的凋亡率,并用AMPK shRNA下调AMPK后观察血管内皮细胞的凋亡率。同时用Western blot法检测脑血管内皮细胞中Bcl-2、Cl-caspase3的表达,用活性氧检测试剂盒检测乏氧下下调AMPK后脑血管内皮细胞ROS的产生量。结果：我们发现在小鼠脑血管内皮细胞主要表达AMPKα2,且磷酸化AMPK在乏氧条件下增加。当抑HIF-1α后,磷酸化的AMPK下降,同时AMPK也下降,证明乏氧能促进HIF-1α表达,能促进AMPK的活化。AMPK能促进细胞增殖。AMPK能抑制细胞凋亡,可能是通过抑制caspase3和促进Bcl-2实现的。干扰AMPK能增加线粒体ROS的产生量。第二部分乏氧条件下AMPK-mTOR调节脑血管内皮细胞自噬目的：观察乏氧时脑血管内皮细胞的自噬情况。研究乏氧促进细胞自噬是通过HIF-1进行的；研究AMPK与细胞凋亡的关系。研究mTOR对血管内皮细胞的作用及是否受AMPK调控,并初步探讨乏氧时脑血管内皮中凋亡和自噬的关系。方法：将CMEC进行乏氧处理,用免疫荧光观察LC3蛋白的分布,Western blot检测乏氧条件下CMEC的LC3 I、LC3 II亚型蛋白表达,并观察下调AMPK后期的表达情况。为研究乏氧促进细胞自噬是通过HIF-1进行的,脑血管内皮细胞用HIF-1的抑制剂处理,用Westeren Blot检HIF-1α磷酸化AMPK、LC3 Ⅰ、LC3 Ⅱ亚型蛋白的表达。用免疫沉淀检测下调AMPK后,脑血管内皮细胞中Bcl-2和Beclin的表达。为了研究AMPK与细胞凋亡的关系,我们检测了在AMPK下调的脑血管内皮细胞caspase-8活性及Bid的表达。为研究mTOR对血管内皮细胞的作用及是否受AMPK调控,我们将乏氧培养的脑血管内皮细胞AMPK下调,Westernblot观察脑血管内皮细胞中AMPK、mTOR、P-mTOR、S6K、P-S6K的表达；为进一步研究mTOR、AMPK和自噬之间的关系,我们用shRNA方法处理脑血管内皮细胞,Western blot检测mTOR、LC3表达,用免疫荧光观察细胞内LC3的分布,免疫沉淀检测脑血管内皮细胞中Bcl-2和Beclin的表达。结果：乏氧时,LC3蛋白重新分配到不同的点,说明细胞正经历自噬,而对照组细胞则散布于细胞内,Western blot显示乏氧条件下CMEC的LC3 II亚型蛋白水平增加,下调AMPK后,LC3 II亚型蛋白水平下降,证明乏氧条件下血管内皮细胞自噬增加。HIF-1被抑制后磷酸化AMPK显著降低,说明HIF-1可能通过活化AMPK诱导细胞自噬。乏氧时,对照组血管内皮细胞有较低的水平capase-8活性,而在AMPK下调细胞caspase-8活性增加,Bid表达增加,说明乏氧条件下,AMPK抑制脑血管内皮细胞凋亡。下调脑血管内皮细胞AMPK后,P-S6K水平增加,但总mTOR、S6K水平没有明显改变,说明AMPK抑制后,mTOR、S6K激活；抑制：mTOR表达后,CMEC的LC3 II亚型蛋白水平增加,mTOR表达下调细胞免疫荧光LC3染色,结果表明mTOR抑制后,细胞自噬能力增强,证明了乏氧条件下,mTOR抑制脑血管内皮细胞自噬。同时发现在mTOR表达下调细胞Bcl-2显著增加,证明乏氧时,脑血管内皮细胞自噬增加后抑制凋亡。结论本课题证明了乏氧条件下,AMPK-mTOR有促进脑血管内皮细胞增殖、抑制其凋亡和促进其自噬的功能,并探讨了其分子机制,为临床治疗脑血管相关的疾病奠定了一定的理论基础。