刚地弓形虫（Toxoplasma gondii,T.gondii）是一种严格的细胞内寄生虫,在弓形虫的生活史中,速殖子可引起中间宿主的急性感染,在这一感染性阶段,无性生殖是其主要的繁殖方式。若没有宿主免疫应答对虫体繁殖的抑制,弓形虫速殖子可以进行不断的繁殖。原癌基因是一些可以影响细胞生长和繁殖的正常细胞基因,一旦他们的表达发生改变,则会促进癌症的发生。那么弓形虫速殖子的不断繁殖与癌细胞的不可控生长有没有关联,目前暂无相关的报道。组蛋白是一种小分子的保守蛋白质,它占染色质总重量的50%,并可以通过修饰调节DNA中所含信息。因而目前弓形虫组蛋白的研究也主要集中于表观遗传学方向,而未见针对组蛋白其他功能研究的报道。在本研究中通过对弓形虫的基因组序列进行分析,分别选取弓形虫酪氨酸激酶样蛋白（Tyrosine kinase-like protein,TKL）,Ras 家族蛋白（Ras family protein,Ras）,Rab小 GTPase（Rab 18/RabC-family small GTPase,Rab18）,Rab43,真核起始因子（Eukaryotic Initiation Factor,eIF-5A）来研究原癌基因对弓形虫繁殖等功能的影响。运用CRISPR/Cas9技术对上述基因进行缺失后,无虫体存活,从而证明上述原癌基因是弓形虫速殖子生长所必须的基因。在后续试验中,我们对Rab18,Rab43和eIF-5A进行进一步功能研究。此外,我们还对弓形虫组蛋白H3和H4对小鼠巨噬细胞的功能影响进行了分析。本项研究对弓形虫速殖子繁殖机制的阐明具有重要意义,可以为虫体与宿主之间的相互作用研究提供参考。1刚地弓形虫原癌基因缺失株的构建本章研究中,通过定点突变试剂盒将弓形虫TKL,Ras,Rab18,Rab43,eIF-5A和对照基因钙依赖蛋白激酶3（Calcium-dependent protein kinase,CDPK3）的特异性sgRNA替换CRISPR/Cas9载体内的sgRNA,用多片段快速克隆试剂盒构建具有Pyrimethamine抗性片段DHFR的同源重组替换载体。经过PCR和酶切等方法鉴定,所有载体均得到大小正确的目的条带。并通过测序验证,证实载体构建成功。用电转染方法将CRISPR/Cas9载体和DHFR抗性同源替代载体共转染RH株弓形虫速殖子。经1μM Pyrimethamine药物筛选后,提取虫体基因组进行PCR验证,结果发现在CDPK3对照基因的的虫体基因组中获得目的大小一致的条带,且经测序验证,弓形虫CDPK3基因被成功替换。而其他原癌基因均无缺失虫体。独立实验进行五次,均无法获得基因缺失株。因而表明,弓形虫肿瘤原癌基因TKL,Ras,Rab18,Rab43和eIF-5A是虫体生长所必需的基因。2刚地弓形虫eIF-5A对小鼠巨噬细胞功能及虫体繁殖的影响本章研究中,获得了刚地弓形虫eIF-5A（TgeIF-5A）的重组蛋白,通过重组蛋白与小鼠巨噬细胞的共孵育,分析其对巨噬细胞功能的影响。结果显示eIF-5A蛋白能够促进巨噬细胞的增殖,吞噬和凋亡,并能够促进巨噬细胞分泌一氧化氮（NO）,白介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子（TNF-α）的水平。但对细胞趋化性和其表面的Toll样受体4（TLR4）表达水平起到抑制作用。我们又选择RNA干扰技术对eIF-5A的功能进行分析,噬斑实验和繁殖实验结果表明在体外条件下,eIF-5A能够调控弓形虫的繁殖过程。粘附实验和侵入实验进一步表明eIF-5A能够减少弓形虫对宿主细胞的粘附,降低侵入细胞的速度。最后通过小鼠毒力实验,表明虫体eIF-5A被干扰后,小鼠的存活时间被延长,弓形虫的毒力明显降低。综上所述,eIF-5A在体外条件下可以影响巨噬细胞的功能,并参与弓形虫侵入宿主细胞和繁殖过程。3刚地弓形虫eIF-5A对虫体蛋白组的影响本章实验的目的是鉴定刚地弓形虫eIF-5A基因所调控的基因的表达情况。将eIF-5A特异性siRNA电转染RH株弓形虫速殖子,孵育24小时后,收集虫体,提取虫体蛋白。用同重同位素相对与绝对定量（Isobaric tags for relative and absolute quantitation,ITRAQ）技术进行蛋白组分析。结果显示,一共有1391条肽段和581个蛋白被鉴定到。将鉴定到的581个蛋白进行表达量差异分析,eIF-5A干扰后,共有359个蛋白表达量发生改变,其中表达量下调的有223个,上调的有136个。通过对结果的分析发现,eIF-5A能够调控多种基因的表达,参与调控重要的信号通路过程。并且在表达量下调的蛋白中包括与弓形虫体侵入和毒力相关的微线体（Microneme）,棒状体（Rhoptry）和致密颗粒（Dense granule）,三个特殊的分泌细胞器分泌的多种蛋白。因而,可以进一步的解释前期实验结论,eIF-5A是弓形虫的必需基因,参与到虫体的侵入与繁殖过程。4刚地弓形虫Rab43对虫体繁殖能力的影响由于Rab43在弓形虫生长繁殖过程中是必需的。为了继续研究Rab43的功能,我们设计合成Rab43特异性小干扰RNA（siRNA）干扰虫体Rab43基因。结果发现,Rab43被干扰之后,弓形虫体对细胞的粘附性和侵入能力均明显下降。噬斑实验表明,Rab43被干扰后,噬斑形成变慢,虫体繁殖速度变慢。对纳虫泡内速殖子个数进行计数,结果发现Rab43干扰后的虫体形成的纳虫泡内含1个速殖子的个数明显高于对照组。最后通过小鼠毒力实验证实Rab43被干扰后,小鼠的存活时间明显延长。综上所述,Rab43是弓形虫的必需基因,在体内和体外条件下,均对弓形虫的繁殖起到重要的作用。5刚地弓形虫CDPK3对虫体繁殖能力的影响本章研究中,对前期试验中获得的CDPK3基因缺失株进行进一步验证。并用体内和体外的方法研究CDPK3对弓形虫体繁殖功能的影响。通过噬斑实验和对含1,2,4,8,16个速殖子的纳虫空泡进行统计,发现在体外条件下CDPK3基因缺失对弓形虫的繁殖作用影响不大。继而我们又通过小鼠体内实验分析CDPK3的作用,结果发现,CDPK3缺失后感染小鼠,能够延长小鼠的存活时间。粘附实验和侵入实验结果表明,CDPK3缺失后,虫体粘附和侵入宿主细胞的能力降低。综上所述,CDPK3缺失能够通过对粘附和侵入的影响,减缓弓形虫的繁殖。6刚地弓形虫Rab18的克隆表达及其对小鼠巨噬细胞功能的调节作用本章试验通过将重组弓形虫Rabl8（TgRab18）蛋白与小鼠巨噬细胞（Ana-1）共孵育,探究其对巨噬细胞功能的影响。采用免疫荧光技术验证rTgRab18在体外环境下与Ana-1细胞的结合情况。利用流式细胞仪检测rTgRab18对Ana-1细胞凋亡、吞噬、TLR4分子表达水平和细胞因子分泌的影响。结果显示,rTgRab18可以与小鼠巨噬细胞发生结合,从而抑制巨噬细胞的增殖、趋化性和细胞表面受体TLR4分子的表达水平。另外实验结果表明,rTgRab 18可以显著促进巨噬细胞的凋亡与吞噬能力。rTgRab 18与巨噬细胞共孵育后,细胞分泌TNF-α,IL-6和NO水平明显上调。以上结果显示,弓形虫组蛋白Rab18在体外条件下影响小鼠巨噬细胞的功能。7刚地弓形虫H3的克隆表达及其对小鼠巨噬细胞功能的调节作用通过构建弓形虫组蛋白3（H3）原核表达质粒pET-32a（+）-TgH3,经IPTG诱导和镍柱纯化获得rTgH3蛋白。对TgH3序列进行分析显示其高度保守。Western blotting结果显示抗TgH3多克隆抗体和人工感染的抗弓形虫血清能分别识别弓形虫全部可溶性抗原和rTgH3蛋白。免疫荧光实验结果显示TgH3可以结合到小鼠巨噬细胞表面。与rTgH3共孵育后,,巨噬细胞的TLR4表达水平降低。此外,巨噬细胞的趋化性和增殖作用被抑制。然而rTgH3能够增强巨噬细胞的吞噬能力,促进细胞的凋亡及细胞分泌NO、IL-6和TNF-α。综上所述,rTgH3在体外条件下能够调节小鼠巨噬细胞的功能。8刚地弓形虫H4的克隆表达及其对小鼠巨噬细胞功能的调节作用在本部分研究中,通过将重组弓形虫组蛋白H4（TgH4）与小鼠巨噬细胞（Ana-1）共孵育后,观察巨噬细胞免疫功能的改变。将重组TgH4与Ana-1细胞共孵育,用免疫荧光技术检测rTgH4与Ana-1细胞的结合情况。用流式细胞术检测rTgH4对Ana-1细胞凋亡、吞噬、TLR4分子表达水平和细胞因子分泌的影响。结果显示,rTgH4能够与小鼠巨噬细胞结合,进而抑制巨噬细胞的增殖、趋化性和细胞表面受体TLR4分子的表达。但rTgH4对巨噬细胞的凋亡和吞噬作用起到明显的促进作用。rTgH4与巨噬细胞共孵育后,细胞分泌细胞因子TNF-α,IL-6和NO的水平明显上调。上述结果显示,弓形虫组蛋白H4在体外条件下可以调节小鼠巨噬细胞的功能。