【摘 要】
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背景与目的:中性粒细胞在肿瘤发病机理中的作用一直是研究的热点,其在肿瘤中所表现的功能并不相同。但是,引起中性粒细胞发挥促瘤或抗瘤作用的机制仍不明确。在本研究中,我们发现TGF-β1和IL-17A在口腔鳞癌组织内高表达及中性粒细胞的大量浸润。因此,本实验将探讨TGF-β1和IL-17A对口腔鳞癌内中性粒细胞的表型影响,并探究极化的中性粒细胞对口腔鳞癌细胞的调控机制。方法:运用免疫荧光染色法观察口腔鳞
【基金项目】
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项目名称:癌细胞外环境对进展期口腔癌的分子靶向药物敏感性的影响研究,项目合同编号:81360403,项目来源:国家自然科学基金,项目起止时间:2014.1—2017.12; 项目名称:中性粒细胞活性氧产物在早期预测口腔鳞癌转移中的应用研究,项目合同编号:2019GXNSFAA185054,项目来源:广西自然科学基金,项目起止时间:2019.9—2022.9
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背景与目的:中性粒细胞在肿瘤发病机理中的作用一直是研究的热点,其在肿瘤中所表现的功能并不相同。但是,引起中性粒细胞发挥促瘤或抗瘤作用的机制仍不明确。在本研究中,我们发现TGF-β1和IL-17A在口腔鳞癌组织内高表达及中性粒细胞的大量浸润。因此,本实验将探讨TGF-β1和IL-17A对口腔鳞癌内中性粒细胞的表型影响,并探究极化的中性粒细胞对口腔鳞癌细胞的调控机制。方法:运用免疫荧光染色法观察口腔鳞癌组织内中性粒细胞的浸润情况。采用免疫组化染色法检测口腔鳞癌组织内TGF-β1和IL-17A的表达水平。利用TGF-β1和IL-17A细胞因子体外直接刺激分离纯化后的人中性粒细胞,然后运用荧光定量PCR检测其表型相关基因MMP9、CCL3（又称MIP-1α）、VEGF-A、ICAM-1、BV8和TRAIL的表达情况。免疫荧光染色法确定口腔鳞癌组织内多种免疫细胞是否会产生TGF-β1及IL-17A。运用TGF-β1和IL-17A联合刺激后的中性粒细胞的条件培养基刺激口腔鳞癌细胞系SAS和SCC9,观察其相关功能变化及变化的机制。通过免疫荧光染色和荧光定量PCR检查口腔鳞癌患者肿瘤组织中及外周血内中性粒细胞相关表型标志物的表达水平。结果:（1）免疫荧光染色显示,中性粒细胞大量浸润至口腔鳞癌组织内;（2）通过Oncomine数据库及免疫组化分析发现在口腔鳞癌组织内,TGF-β1及IL-17A的基因及蛋白表达水平均高于正常口腔粘膜;（3）生存分析结果显示,高表达TGF-β1的口腔鳞癌患者术后的生存率较低,而IL-17A的表达高低与患者的术后生存率并无明显相关性;（4）TGF-β1和IL-17A细胞因子体外联合作用可以诱导中性粒细胞向促瘤表型极化,表型相关基因MMP9、VEGF-A及BV8表达升高,CCL3、ICAM-1和TRAIL表达下降。而TGF-β1或IL-17A体外单独刺激中性粒细胞不会诱导其表型改变;（5）采用Bio GPS数据库发现人体内多种免疫细胞均可表达TGF-β1和IL-17A,通过免疫荧光染色法初步确定在口腔鳞癌组织内,CD14+单核细胞,CD8+T细胞及CD56+NK细胞均表达TGF-β1和IL-17A;（6）Transwell实验、细胞划痕实验、平板克隆实验、干细胞成球实验及CCK-8结果显示,TGF-β1联合IL-17A激活的中性粒细胞条件培养基可以增强口腔鳞癌细胞的迁移、增殖、侵袭能力及干性;（7）荧光定量PCR及Western Blot结果显示运用TGF-β1联合IL-17A激活的中性粒细胞条件培养基刺激口腔鳞癌细胞后,其上皮间充质转化（EMT）相关标志物MMP9、MMP2、N-CAD及VIM的mRNA及蛋白表达水平均升高,E-CAD的mRNA及蛋白表达水平下降,同时发现EMT相关标志物的变化是通过NF-κB信号通路调控的;（8）免疫荧光染色显示口腔鳞癌组织内中性粒细胞MMP9表达升高,CCL3表达下降;（9）我们收集了83名口腔鳞癌患者术前外周血及40名健康志愿者的外周血,提取其中性粒细胞并运用荧光定量PCR检测其MMP9及CCL3的表达水平,结果发现相较健康志愿者,口腔鳞癌患者的外周血中性粒细胞内MMP9表达升高而CCL3表达下降。受试者工作特征（ROC）曲线分析表明,单独使用中性粒细胞MMP9及CCL3检测口腔鳞癌时的曲线下面积（AUC）分别为0.871和0.852,而联合检测中性粒细胞MMP9及CCL3时的AUC增加到了0.912,其灵敏度及特异度分别为79.5%和92.5%。结论:TGF-β1协同IL-17A可以诱导中性粒细胞向促瘤表型极化从而促进口腔鳞癌的发展,其主要机制为通过NF-κB信号通路调控了口腔鳞癌细胞的EMT进程。此外,联合检测外周血中性粒细胞相关标志物有望成为一种筛查口腔鳞癌的新方法。
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