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研究目的:全球有超过3.5亿人患有慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染,每年因急性肝功能衰竭,失代偿性肝硬化和肝细胞癌(HCC)导致约100万人死亡。乙型肝炎病毒编码四种蛋白,其中HBV DNA聚合酶是一种多功能酶蛋白(称为HBV-DNA-Pol)。最近已有报道发现HBV-DNA-Pol对肝癌的发生发展具有促进作用,乙型肝炎病毒感染后在病人发生肝癌前,先后要经历肝炎、肝纤维化和肝硬化,继而发展为肝癌。HBV-DNA-Pol对肝癌的发生发展具有促进作用,那么其对肝纤维化的形成是不是有促进作用?然而,至今为止在这一方面研究非常少。因此,本课题主要研究HBV-DNA-Pol对肝纤维化的影响及作用机制。研究方法:我们首先做了体外细胞实验,在肝星状细胞中过表达HBV-DNA-Pol,然后用不同浓度的转化生长因子(TGF-β1)进行刺激,而后通过Western Blotting和RT-qPCR对纤维化指标进行检测。因为纤维化的形成会在细胞形态上有明显的特征,进而我们通过观察过表达HBV-DNA-Pol组的细胞形态相比对照组变细长,表明细胞在形态上发生了纤维样变化。为了进一步验证,我们又做了体内动物实验,通过包装过表达HBV-DNA-Pol的腺相关性病毒进行尾静脉注射C57BL/6小鼠,然后通过腹腔注射10%CL4来诱导小鼠肝纤维化形成,最后通过病理组织切片进HE染色、天狼星红染色以及免疫组化染色进行纤维化指标检测,并且也通过Western Blotting和血清羟脯氨酸含量检测纤维化指标。为了进一步研究HBV-DNA-Pol对肝纤维化形成有促进作用的机制,我们实验室前期已经通过采取Flag亲和纯化技术联合质谱分析进行筛选HBV-DNA-Pol相互作用蛋白,并且在GeneCard和Pubmed等网站查询相关基因功能。最终选取HSPA8做研究对象,并构建其相应的过表达及敲降质粒。通过CoIP实验及免疫荧光共定位实验分析确定与HBV-DNA-Pol相互作用及细胞共定位。通过Western Blotting实验检测HBV-DNA-Pol对HSPA8表达的影响。已有文献报道HSPA8是细胞自噬抑制因子,并且细胞自噬的激活能促进纤维化形成。因此,我们通过Western Blotting实验和细胞自噬实验对HBV-DNA-Pol及HSPA8进行研究。研究结果:我们通过体外细胞实验在肝星状细胞中过表达HBV-DNA-Pol,然后进行转化生长因子(TGF-β1)刺激,发现HBV-DNA-Pol对肝纤维化的形成具有促进作用。为了进一步验证,我们又通过体内动物模型实验发现HBV-DNA-Pol在CCL4诱导的小鼠肝纤维化形成过程中具有促进作用。Flag亲和纯化技术联合质谱分析发现HSPA8等有可能是HBV-DNA-Pol相互作用蛋白,通过免疫荧光共定位及免疫沉淀实验证实了HBV-DNA-Pol与HSPA8相互作用。HBV-DNA-Pol与HSPA8相互作用会介导HSPA8表达下调。HSPA8下调对细胞自噬有促进作用,并且细胞自噬的激活会促进纤维化形成。研究结论:本研究发现HBV-DNA-Pol对肝纤维化的形成的促进作用是通过下调HSPA8的表达来实现的,而HSPA8的下调又能促进细胞的自噬,细胞自噬的激活有助于纤维化的形成,从而得到HBV-DNA-Pol有助于肝纤维化形成是通过下调HSPA8的表达进而促进细胞自噬来完成的。这为HBV感染所致的肝纤维化的形成提供新的解释,也可能为肝纤维化的诊治研究提供了新的分子基础。