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第一部分滇南小耳猪BMSCs体外培养与鉴定[目的]探讨滇南小耳猪骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）体外高效扩增的方法,并对培养的细胞进行鉴定,为后续实验奠定基础。[方法]采用离心加贴壁法培养抽取的滇南小耳猪骨髓。流式细胞仪检测P0、P1、P2代BMSCs CD29、CD44、CD45的表达；取P2代细胞行成脂、成骨和成软骨诱导分化,分别用油红O、茜素红、阿利新蓝染色检测BMSCs多向分化的能力。[结果]（1）原代细胞形态为梭形,克隆样生长,细胞长满时呈漩涡样；传代后细胞形态变大,早期呈现三角形及多边形。三角形细胞增殖较快,细胞长满培养瓶时形态类似于原代细胞。随着传代次数的增加,多边形细胞逐渐增多,细胞形态呈宽大扁平状,折光性降低,细胞增殖缓慢。（2）流式细胞检测P0、P1、P2代CD29阳性率分别为：73.10%、99.44%、99.49%；CD44阳性率分别为：69.74%、99.96%、99.52%；P1、P2代与P0代比较,组间有统计学意义（P<0.05）；CD45阴性率为：99.68%、95.81%、99.93%,组间比较无统计学意义（P>0.05）。（3）BMSCs经成脂诱导10天,细胞内出现脂滴,油红O染色阳性；成骨诱导14d后,细胞外基质中有钙结节形成,茜苏红染色阳性；成软骨诱导21d后,细胞基质呈蓝色,阿利新蓝染色阳性；[结论]（1）离心加贴壁法可以成功培养并高效扩增滇南小耳猪BMSCs。（2）扩增至P2代以后的BMSCs具有较高纯度,且保持多向分化潜能,可作为组织工程的种子细胞。第二部分Ad-BMP-2-EGFP、Ad-TGF-β3载体的构建及其体外诱导BMSCs成软骨分化的实验研究[目的]分别构建含BMP-2、TGF-β3基因的重组腺病毒载体,双基因联合转染滇南小耳猪BMSCs并检测其表达,并对其体外诱导BMSCs成软骨分化能力进行检测。[方法]用PCR方法扩增人BMP-2和TGF-β3目的基因,将2个基因分别亚克隆至穿梭载体pEC3.1（+）中（其中与BMP-2连接的穿梭载体pEC3.1经改构,带有EGFP标签）,构建pEC-GIE3.1-BMP-2-EGFP和pEC-GIE3.1-TGF-β3重组质粒,通过体外同源重组反应将pEC-GIE3.1-BMP-2-EGFP、pEC-GIE3.1-TGF-β3重组至腺病毒骨架质粒pGSadeno中,构建重组腺病毒表达质粒pGSadeno-BMP-2、pGSadeno-TGF-β3,线性化后转染HEK293细胞进行包装,获得重组腺病毒Ad-BMP-2和Ad-TGF-β3。体外扩增培养滇南小耳猪BMSCs,分别用Ad-BMP-2（A组,MOI=20）、Ad-TGF-β3（B组,MOI=50）和Ad-BMP-2+Ad-TGF-β3（C组,MOI=20、50）转染,以未转染细胞作为对照（D组）。免疫荧光、Western-blot, ELISA、PCR检测目的基因的表达,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色及RT-PCR观察其诱导BMSCs成软骨分化情况。[结果]Ad-BMP-2和Ad-TGF-β3经PCR及测序鉴定,带有BMP-2、TGF-β3基因的腺病毒载体在HEK293细胞中包装成功,Ad-BMP-2和Ad-TGF-β3病毒滴度分别为5.6×108、1.6×108pfu/mL。Ad-BMP-2和Ad-TGF-β3双基因共转染滇南小耳猪BMSCs72h后,免疫荧光显示：A组、B组胞浆内有分别有红色、绿色荧光表达,C组同时表达红色及绿色荧光,D组未见红、绿荧光表达。PCR显示：A组在310bp处可见条带,B组在114bp处可见条带,C组在310、114bp处同时可见条带,D组未见目的条带表达：ELISA检测显示：A、B、C组上清液中检测到目的基因表达,D组未见相关基因表达。Western-blot显示：A组在18kd处有阳性条带,B组在50 kd处有阳性条带,C组在18、50 kd处可见条带,D组未见目的条带表达。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示A、B、C组呈阳性,C组染色强于A、B组,D组染色呈阴性；RT-PCR显示转染后1W,2W,3W同时间点比较,C组COL-2A、ACAN、SOX9相对表达量均高于A、B组。[结论]（1）成功构建了分别带有BMP-2和TGF-β3基因的重组腺病毒载体,Ad-BMP-2和Ad-TGF-β3转染滇南小耳猪BMSCs后目的基因可成功表达。（2）与单基因转染相比,Ad-BMP-2和Ad-TGF-β3双基因联合转染滇南小耳猪BMSCs可促进BMSCs更加有效地分化为软骨细胞。穿梭载体pEC3.1（+）中（其中与BMP-2连接的穿梭载体pEC3.1经改构,带有EGFP标签）,构建pEC-GIE3.1-BMP-2-EGFP和pEC-GIE3.1-TGF-β3重组质粒,通过体外同源重组反应将pEC-GIE3.1-BMP-2-EGFP、pEC-GIE3.1-TGF-β3重组至腺病毒骨架质粒pGSadeno中,构建重组腺病毒表达质粒pGSadeno-BMP-2、pGSadeno-TGF-β3,线性化后转染HEK293细胞进行包装,获得重组腺病毒Ad-BMP-2和Ad-TGF-β3。体外扩增培养滇南小耳猪BMSCs,分别用Ad-BMP-2（A组,MOI=20）、Ad-TGF-β3（B组,MOI=50）和Ad-BMP-2+Ad-TGF-β3（C组,MOI=20、50）转染,以未转染细胞作为对照（D组）。免疫荧光、Western-blot, ELISA、PCR检测目的基因的表达,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色及RT-PCR观察其诱导BMSCs成软骨分化情况。第三部分BMP-2、TGF-β3壳聚糖缓释微球/DBM复合支架的构建及其生物学特性研究[目的]制备BMP-2、TGF-β3壳聚糖缓释微球/DBM复合支架,并研究其相关生物学特性。[方法]（1）采用乳化交联法制备BMP-2.TGF-β3壳聚糖缓释微球,扫描电镜观察其形貌及粒径,ELISA双抗体夹心法测定载药量、包封率及体外药物缓释率。（2）体外扩增培养滇南小耳猪BMSCs,分别与BMP-2壳聚糖缓释微球（A组）、TGF-β3壳聚糖缓释微球（B组）和BMP-2、TGF-β3壳聚糖缓释微球（C组）共培养,以壳聚糖空白微球作为对照（D组）。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色、ELISA、RT-PCR观察各组诱导BMSCs成软骨分化情况。（3）根据Urist描述的方法制备DBM,扫描电镜观察DBM的超微结构及其孔隙率。（4）使用0.02%EDC作为交联剂,将DBM与BMP-2、TGF-β3壳聚糖缓释微球复合,制备BMP-2、TGF-β3壳聚糖缓释微球/DBM复合支架。对复合支架作电镜扫描观察,以及红外光谱检测,与干细胞共培养,评价其生物相容性。[结果]（1）壳聚糖缓释微球平均粒径53.38μm,呈球形,BMP-2、TGF-β3包封率分别为65%、76%,载药量为19.5ng/mg,11.4ng/mg;药物释放试验表明BMP-2和TGF-β3可以从微球中缓慢释放,第7天累积释放量达69%、62%；（2）ELISA检测显示：A、B、C组上清液中检测到相关因子表达,D组未见表达。同一时间点比较,缓释载体相应因子含量低于病毒载体组；Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示C组染色强于A、B组,D组染色呈阴性；RT-PCR显示1W,2W,3W同时间点比较,C组CCL-2A、ACAN相对表达量均高于A、B组；同一时间点比较,缓释载体相应因子含量低于病毒载体组；（3）DBM支架材料外观呈白色海绵状,SEM观察DBM具有三维网状结构,平均孔隙直径为119.42±6.46μm。（4） BMP-2. TGF-β3壳聚糖缓释微球/DBM复合支架材料外观呈黄白色,SEM显示：微球均匀地分布于DBM内,红外线光谱检测提示：微球与DBM形成稳定的共价结合。[结论]BMP-2、TGF-β3壳聚糖缓释微球/DBM复合支架,在不改变DBM基本性能基础上,赋予支架载药缓释能力,提高外源性生物因子的生物利用度,为组织工程提供了改良的支架。第四部分携载BMP-2、TGF-β3双基因的腺病毒载体与双因子缓释载体复合BMSCs构建的组织工程软骨修复猪关节软骨缺损的对比研究[目的]比较携载BMP-2、TGF-β3双基因腺病毒载体、壳聚糖缓释载体复合BMSCs构建的组织工程软骨修复猪关节软骨缺损的效果。[方法] 体外分别构建携载BMP-2、TGF-β3双基因的BMSCs/DBM组织工程软骨、BMP-2、TGF-β3壳聚糖缓释微球/DBM/BMSCs组织工程软骨；成年滇南小耳猪9头,18膝,共建立36个软骨缺损模型；实验分组：Ⅰ组：右膝股骨外髁负重面缺损处植入BMP-2、TGF-β3壳聚糖缓释微球/DBM/BMSCs;Ⅱ组：右膝股骨内髁负重面缺损处植入BMP-2、TGF-β3双基因转染的BMSCs/DBM;Ⅲ组：左膝股骨内髁负重面缺损处植入DBM+BMSCs; Ⅳ组：左膝股骨外髁负重面缺损处单纯植入DBM；于术后4、8、12周取材进行大体观察、组织学观察和组织学O’driscoll评分。[结果]软骨缺损修复术后12周,Ⅱ组缺损区被光滑、乳白色类软骨组织填充,HE染色显示缺损区修复组织有典型的透明软骨结构,与正常软骨界限不清,优于Ⅰ、Ⅲ 、Ⅳ组。O’driscoll评分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组分别为：11.03±1.08、13.65±1.33、9.13±0.55、7.38±1.35,组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。[结论]携载BMP-2、TGF-β3双基因的BMSCs联合DBM构建的组织工程软骨修复关节软骨缺损的效果优于BMP-2、TGF-β3壳聚糖缓释微球/DBM复合支架。