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采用不同方法对鸭胚增殖的DHV-1进行病毒纯化，并比较几种方法的纯化效果，利用纯化的DHV-1抗原制备特异性的兔抗DHV-1 IgG，用SDS-PAGE检测DHV-1完全病毒粒子的结构蛋白，Western-bloting分析其抗原相关蛋白。同时，在了解小RNA病毒普遍共性的基础上，对DHV-1的基因组结构进行生物信息学分析。初步了解DHV-1的分子生物学背景，为明确其分类地位，更为开发DHV-1基因工程疫苗，建立方便快捷的诊断方法提供理论依据。获得如下结果：1．鸭胚增殖的DHV-1的提纯及提纯方法比较DHV-1 H株种毒(ELD50为106.5／0.2ml)经鸭胚尿囊腔途径增殖后，收集含毒尿囊液及胎衣，分别采用超滤浓缩法、PEG 6000包埋浓缩法、差速离心法和PEG 6000包埋浓缩+差速离心法进行提纯比较，以PEG 6000包埋浓缩+差速离心法获得较纯的病毒粒子。收获的DHV-1蛋白含量为15.761mg／ml，OD260／OD280值为1.063，能用于免疫血清的制备和SDS-PAGE检测。各种方法纯化的DHV-1，毒力均能维持在106.5左右，且对1日龄雏鸭的致死率均在87.5％以上。透射电镜检测结果显示，超滤浓缩法提纯的病毒样品中可观察到少数病毒粒子，杂质较多；PEG 6000包埋浓缩法的样品病毒粒子较多，但杂质也较多；氯仿处理后直接进行差速离心法提纯的样品虽然杂质较少但只能见少量单个病毒粒子；而PEG 6000包埋浓缩+差速离心法提纯的病毒样品所观察到的病毒粒子最多，杂质较少。2．兔抗DHV-1 IgG的制备、纯化及检测应用免疫删减技术，以正常鸭胚尿囊液和环磷酰胺对试验兔进行预处理，再将DHV-1抗原灭活、乳化后对预处理兔进行多次免疫，并采集兔血进行琼脂扩散试验，至检测血清效价达1：64以上时，开始收集兔抗DHV-1血清为实验材料。用正辛酸—饱和硫酸铵（SAS）法粗提兔抗DHV-1血清，然后用重组蛋白A FF琼脂糖凝胶亲和层析法纯化兔抗DHV-1 IgG。SDS-PAGE检测表明，纯化后的IgG在8％非变性SDS-PAGE图谱中显示为1条分子量为160kDa的蛋白带，在12％变性SDS-PAGE图谱中显示为2条分子量分别为55kDa和25kDa的蛋白带。同时，纯化后的兔抗DHV-1 IgG病毒中和抗体效价达1：2000。表明所制备的兔抗DHV-1 IgG具有高纯度、特异性。3．鸭肝炎病毒（DHV-1）结构蛋白及抗原相关蛋白检测与分析对纯化的DHV-1与正常鸭胚尿囊液进行平行SDS-PAGE，筛减二者差异性。在12％SDS-PAGE图谱中筛选出2条分子量在20～30kDa的DHV-1结构蛋白带，在15％SDS-PAGE图谱中筛选出4条分子量在7～30kDa的DHV-1结构蛋白带。利用专业凝胶图象扫描软件Quantity One?，对照标准蛋白质Maker进行分子量测算，12％SDS-PAGE图谱中筛选的2条蛋白带分子量分别为27.43kDa和20.56kDa，15％SDS-PAGE图谱中筛选的4条蛋白带分子量分别为27.43kDa、25.59kDa、20.56kDa和7.72kDa。Western-bloting检测表明，分子量为27.43kDa的蛋白带为DHV-1抗原相关蛋白。对截止到2007.04 NCBI数据库中公布的DHV-1全基因组进行生物信息学分析，结果表明DHV-1具有典型的小RNA病毒基因组结构特征。DHV-1含单股正链RNA，全长7582～7712nt（包括3’poly A尾）。RNA基因组的顺序依次为5’UTR、COS和3’UTR。其中5’UTR长600～626nt，不含帽子结构；3’UTR长269～341nt，含6～21nt不等的3’poly（A）尾；ORF长6750nt，编码2249个aa，表达病毒的多聚蛋白。9株DHV-1核苷酸序列同源性为94.4％～99.5％，多聚蛋白氨基酸序列同源性高达97.1％～99％。各株DHV-1的ORF均从600～626nt处以ATG开始翻译，在7350～7376nt处以TGA结束。9株DHV-1多聚蛋白共有138个氨基酸有差别，占全部氨基酸数的6.1％，其中发现4个完全保守的氨基酸区域，3个变异最集中的氨基酸区域和11个变异最大的氨基酸位点。在DHV-1多聚蛋白的第1757～1761aa位，均出现小RNA病毒3C蛋白酶(3Cpro)的高度保守基序Gly-Ser-Cys-Gly-Gly（G-X-C-G-G），推测这一区域将编码产生DHV-13C蛋白。NCBI数据库中公布的8株DHV-1 VP1区长度均为714nt，编码238个aa，预测分子量为26.4kDa左右。除ZG-A株外，其他几株核苷酸序列同源性高达99.3％～99.9％；SY1、SY2、SY3和SY6株氨基酸序列同源性为100％，SY4株仅第49位Ser被Leu取代，AV2111株第29位His被Arg取代，SY5株第10、232位Glu被Gly取代；ZG-A株与其他各株氨基酸同源性较低，共有10个氨基酸发生变化。同时发现VP1的50～122aa区域完全保守，其潜在的抗原决定簇广泛分布在整个VP1区，除ZG-A株外，其他几株DHV-1 VP1区抗原决定簇的氨基酸序列相当保守，推测它们均属同一血清型。DRL-62、R85952、S、ZJ和H株的核苷酸序列亲缘关系较近。5886、DRL-62、03D、C80和JX株的多聚蛋白氨基酸序列亲缘关系较近。同时，DHV-1在小RNA科病毒多聚蛋白氨基酸序列进化树上是一个独立的进化分枝，该分枝与埃可病毒属（Parechovirus）亲缘关系较近，显示DHV-1可能是小RNA病毒科的一个新属病毒。预测DHV-1全长多聚蛋白总共被切割成12个成熟产物，形成其结构蛋白与非结构蛋白。切割位点分别为：1A／1B（VP4／VP2）、1AB／1C（VP0／VP3）、1C／1D（VP3／VP1）和3C／3D为Q／G，1D／2A1为E／S，2A1／2A2为NPG／P，2A／2B、2B／2C、2C／3A和3A／3B为Q／S，3B／3C为E／T，这与小RNA病毒多聚蛋白加工特点相符。测算DHV-1结构蛋白VP4含75个aa、VP2含181个aa、VP3含237个aa和VP1含238个aa，分子量分别为7.72、20.56、26.59和27.02kDa，这与本研究中的DHV-1完全病毒粒子SDS-PAGE检测结果基本一致。