第一部分:问号钩端螺钩体通过FasL/Fas途径诱导小鼠巨噬细胞凋亡及TLR-2与p38MAPK/JNK信号通路的调节作用研究背景和目的:钩端螺旋体(简称钩体)病是全世界流行的人兽共患病,致病性钩体侵入人体后能引起急性发热和全身各系统的疾病,其临床综合症包括亚临床感染、伴有或不伴有脑膜炎的无黄疸的自限性发热、以出血、黄疸、肾衰竭症状为特征的潜在性致命的Weil’s综合症。钩体病的致病因素如:脂多糖、脂蛋白、肽聚糖、热休克蛋白及鞭毛蛋白等可能与致病性有关,但确切的致病机制至今未明。虽然有报道问号钩体能侵入细胞并诱导小鼠单核巨噬样细胞(J774A.1)发生细胞凋亡,然而其凋亡机制尚不清楚。FasL/Fas途径是细胞凋亡最常见的途径之一,本研究旨在了解FasL/Fas途径是否参与问号钩端螺旋体诱导的细胞凋亡及其相关信号通路的调控作用。方法:采用酚水法和Triton X-114法分别提取问号钩体56601株脂多糖(L-LPS)和外膜蛋白(L-OMP)。采用流式细胞术定量检测问号钩体感染、L-LPS或L-OMP作用后J774A.1细胞的凋亡率及抗小鼠FasL中和抗体对细胞凋亡的阻断作用;采用PE标记的抗小鼠FasL或Fas单克隆抗体染色,荧光显微镜观察问号钩体感染、L-LPS或OMP作用前后J774A.1细胞FasL/Fas表达水平变化;采用流式细胞术定量检测问号钩体感染、L-LPS或OMP作用前后J774A.1细胞FasL/Fas表达水平变化;采用实时荧光定量PCR定量检测问号钩体感染、L-LPS或OMP作用前后J774A.1细胞FasL/Fas mRNA表达水平变化;采用流式细胞术分别检测抗小鼠Toll样受体(TLR2和TLR4)中和抗体及p38MAPK、JNK和ERK信号通路阻断剂对问号钩体感染、L-LPS或OMP作用的J774A.1细胞FasL/Fas表达的阻断作用。结果:流式细胞术对细胞凋亡率及FasL中和抗体的阻断作用检测结果表明,问号钩体、L-LPS及L-OMP均能诱导细胞凋亡,抗小鼠FasL中和抗体对问号钩体感染及L-LPS处理4 h J774A.1细胞的凋亡阻断率分别为60.03%和83.47%(P<0.05),而对L-OMP诱导的J774A.1细胞凋亡没有明显的阻断作用(P>0.05)。免疫荧光法与流式细胞术对问号钩体感染、L-LPS处理后细胞FasL/Fas表达水平均出现明显上调,流式细胞术显示问号钩体感染12 h J774A.1细胞FasL和Fas表达率达到最高峰,分别为71.57%和93.57%(P<0.05),L-LPS处理12 h J774A.1细胞FasL和Fas表达率达到最高峰,分别为60.56%和89.54%(P<0.05),而L-OMP作用后细胞FasL/Fas表达水平无明显变化(P>0.05)。实时荧光定PCR法检测结果表明,问号钩体感染和L-LPS处理后细胞FasL/Fas mRNA表达水平明显上调,而L-OMP处理前后J774A.1细胞FasL和Fas mRNA表达水平无明显变化(P<0.05)。流式细胞术检测TLR2和TLR4中和抗体对FasL表达的阻断效应结果显示,TLR-2对问号钩体感染或L-LPS处理12 h后J774A.1细胞FasL表达水平有明显阻断作用,阻断率分别为84%和87.92(P<0.05),TLR-2对问号钩体感染或L-LPS处理12h后J774A.1细胞Fas表达水平有明显阻断作用,阻断率分别为58.07%和61.12%(P<0.05),而TLR-4抗体对问号钩体感染或L-LPS作用的J774A.1细胞FasL和Fas表达水平无明显的阻断效果(P>0.05)。TLR-2或TLR-4对L-OMP处理细胞FasL和Fas表达水平无影响(P>0.05)。流式细胞术检测p38MAPK、JNK和ERK信号通路阻断剂对FasL表达的阻断效应结果显示,p38MAPK、JNK信号通路阻断剂对问号钩体感染或L-LPS处理细胞FasL/Fas表达水平均有阻断作用(P<0.05),且p38MAPK信号通路阻断剂更明显。p38MAPK与JNK信号通路阻断剂对问号钩体感染J774A.1细胞12 h FasL表达阻断率分别为68.20%和29.00%,对LPS作用J774A.1细胞12 h FasL表达阻断率分别为70.04%和42.63%;p38MAPK与JNK信号通路阻断剂对问号钩体感染J774A.1细胞12 h Fas表达阻断率分别为67.33%和18.09%,对LPS作用J774A.1细胞12 hFasL表达阻断率分别为60.93%和28.00%;而ERK阻断剂对FasL和Fas表达没有明显的阻断作用(P>0.05)。p38MAPK、JNK及ERK阻断剂对L-OMP作用细胞FasL/Fas表达均无影响(P>0.05)。结论:诱导细胞凋亡是问号钩体56601株损伤J774A.1细胞的重要机制。问号钩体通过上调靶细胞FasL/Fas表达水平从而诱导J774A.1细胞凋亡,TLR2和p38MAPK/JNK通路参与调控FasL/Fas的表达,且L-LPS是问号钩体通过此途径诱导细胞凋亡的问号钩体外膜成分。此外,问号钩体外膜成分L-OMP同样能诱导细胞凋亡,但L-OMP作用后J774A.1细胞FasL/Fas表达未见上调,且抗小鼠FasL中和抗体对L-OMP诱导细胞凋亡作用无明显阻断效果,提示问号钩体L-OMP中可能有FasL样蛋白成分。第二部分:问号钩端螺旋体在巨噬细胞内存活与繁殖研究背景和目的:钩端螺旋体(简称钩体)病是由致病性钩体引起的全世界流行的人兽共患病,钩体的携带者主要是野生动物或家畜,尤其是啮齿动物、有袋动物、牛、猪和狗。人感染钩体后的临床症状从轻微的症状到多器官衰竭,以黄疸、肺出血和肾衰竭为主要特征。肺弥漫性出血是一症状严重的的钩体病,病死率高达25%。相反,大多数钩体哺乳宿主动物如啮齿类动物只呈现轻微的慢性疾病或无症状感染,且通过尿液向外界终身排菌,造成此不同感染结局的差异至今还不清楚。单核核巨噬细胞是人和哺乳动物体内最有效的吞噬细胞,能够大量地吞噬入侵机体的致病性细菌菌和其他微生物。据以往的研究报道,钩体能在体内和体外被巨噬细胞吞噬,然而间号钩体被巨噬细胞吞噬后的胞内命运至今还不明了。因此本研究旨在了解问号钩体被人和小来源单核巨噬细胞吞噬后胞内命运。方法:本研究采用Fontana银染法检测了问号钩体赖型赖株(56601株)与波摩那型罗株(56608株)对人外周血单核巨噬细胞(HPM)和人单核巨噬样细胞(THP-1)、小鼠腹腔巨噬细胞(MPM)、小鼠骨髓来源巨噬细胞和小鼠单核巨噬样细胞(J774A.1)的粘附能力;采用透射电子显微镜技术观察了问号钩体56601株对感染不同时间后问在人和小鼠巨噬细胞内的分布;采用菌落计数法检测感染不同时间后问号钩体56601株和56608株在人和小鼠巨噬细胞内的繁殖;采用荧光分光光度法检测问号钩体56601株在人和小鼠巨噬细胞内的繁殖;采用细菌活性检测试剂盒染色后流式细胞术检测感染不同时间后的人和小鼠巨噬细胞内分离问号钩体56601株的活性;采用激光共聚焦显微镜法检测检测感染不同时间后的人和小鼠巨噬细胞内问号钩体56601株与溶酶体膜标志蛋白(LAMP-1)的共定位;采用细胞凋亡试剂盒检测了问号钩体56601株感染不同时间后的人和小鼠巨噬细胞的死亡情况。结果:Fontana银染法检测结果表明,问号钩体56601株和56608株对人和小鼠来源巨噬细胞具有相似的粘附率。透射电子显微镜观察结果显示问号钩体56601株在小鼠原代和传代巨噬细胞内被吞噬泡膜包围,随着感染时间的延长,细胞内钩体数量下降,且问号钩体典型形态变得不完整,而大多数钩体在人巨噬细胞内游离在细胞浆内,随着感染时间的延长,细胞内钩体数量增多,钩体保持完整典型形态。菌落计数结果显示,人巨噬细胞在感染后分离细胞内问号钩体56601株和56608株的菌落数随感染时间的延长而增加(P<0.05),而小鼠巨噬细胞在感染后分离细胞内钩体的菌落数随着感染时间的延长而减少。荧光分光光度法检测结果显示,问号钩体56601株感染人巨噬细胞内分离钩体的荧光强度随着感染时间的延长而增强,相反,感染小鼠巨噬细胞内分离钩体的荧光强度随着感染时间的延长而减弱。流式细胞术检测胞内钩体活性结果显示,与培养基培养的新鲜钩体相比,问号钩体56601株感染人巨噬细胞内分离体的活性随感染时间的延长而不变,而感染小鼠巨噬细胞内分离钩体的活性随感染时间的延长而降低(P<0.05)。激光共聚焦显微镜观察结果揭示,感染后人巨噬细胞内钩体56601株和56608株与溶酶体膜标志LAMP-1比率较低并随时间的感染时间的延长减少,而感染后小鼠巨噬细胞内钩体56601株和56608株与LAMP-1的共定位比率随感染时间的延长而增加(P<0.05)。流式细胞术检测感染细胞死亡结果显示,钩体56601株感染小鼠巨噬细胞在感染4 h后早期凋亡率达到最高峰,而感染人巨噬细胞在感染72 h后早期凋亡率达到最高峰,感染人巨噬细胞早期胞凋亡率均较小鼠巨噬细胞低(P<0.05)。透射电子显微镜检测结果显示人和小鼠巨噬细胞分别在问号钩体56601株感染72 h和24 h时出现典型的空泡、染色质固缩及边缘化等细胞凋亡形态学特征。结论:问号钩体对人和小鼠来源的巨噬细胞具有相似的粘附能力,但问号钩体在人和小鼠来源巨噬细胞内的命运截然不同。大多数问号钩体在小鼠巨噬细胞内被吞噬泡膜包围,最终被溶酶体所降解,而大多数问号钩体在人巨噬细胞内分布在细胞浆,存活下来并繁殖。以上结果提示,问号钩体被吞噬后的胞内命运与巨噬细胞的宿主来源有关,这将有助于解释人和宿主动物感染钩体后引起钩体病在严重程度上的差别。