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随着转基因技术的发展,获得特异性强且无生物安全隐患的高效启动子成为研究热点。本实验以蜕皮素诱导系统为介导,在实验室前期已经分离获得的具有较高调控能力兼具肌肉组织特异性表达的a-actin启动子的基础上,将蜕皮素诱导系统调节质粒中可广谱表达外源基因的CMV启动子替换为猪肌肉特异性启动子a-actiin。构建猪肌肉特异性诱导表达系统,并在细胞水平上验证该肌肉特异性诱导系统在表达外源基因时是否兼备组织特异性和可调控性,为基因治疗和外源基因在骨骼肌组织的特异性表达提供实验依据。主要研究结果如下：1.将蜕皮素诱导表达系统调节质粒pVgRXR中的CMV启动子替换为猪肌肉特异性表达的a-actin启动子,选取绿色荧光蛋白EGFP为报告基因构建诱导系统中的反应质粒pIND-EGFP,用于检测双载体表达系统是否可以成功表达外源基因。研究结果表明,本研究构建的肌肉特异性诱导表达系统可启动外源基因的表达。2.将以上系统中的EGFP报告基因替换为p-半乳糖苷酶LacZ基因用于检测该系统的表达活性。实验结果显示该诱导系统报告基因表达量在一定的范围内均与诱导时间和诱导剂量呈正比例关系,分别在诱导时间为72h和诱导剂量在36μM时达到最大值,之后表达基本持平,并发现该系统在分化的C2C12细胞(即肌管)中的表达要极显著高于未分化的C2C12细胞(p<0.01),证明了该系统可在肌管中特异表达。3.利用p-半乳糖苷酶Lac2基因为报告基因,将该肌肉特异性诱导表达系统转染小鼠C2C12细胞,通过G418筛选,成功筛选出能稳定表达p-半乳糖苷酶基因的5株阳性单克隆细胞株,建立了可用于肌肉诱导表达的稳定细胞系,为下一步其它实验提供了基础。4.构建了以猪MyoD基因为外源基因的猪肌肉特异性诱导表达系统pVg-actin/pIND-MyoD,将该系统转染分化7天后的小鼠C2C12细胞,发现诱导剂浓度为36μM,诱导时间为48h的实验组中MyoD基因的表达量是未加诱导剂的对照组表达量的17倍,充分证明了该诱导系统表达外源基因的高效性。