COMT负责人体内多种儿茶酚胺类神经递质(如多巴胺)的代谢失活,从而调控情绪,感觉以及认知功能等多种行为。大量研究表明COMT与精神分裂症、帕金森症等多种神经系统疾病有非常密切的关系,也是帕金森症等疾病的治疗靶点,定量评估复杂生物体系中COMT活性对相关疾病的早期诊断及其治疗药物的开发具有重要意义。然而业界一直缺少复杂生命体系中COMT活性的高效、高灵敏度检测方法。为此,本课题以前期自主研发的首个双光子COMT荧光底物(3-BTD)为核心,针对不同的研究对象和实验目的,分别构建了基于酶标仪高通量检测的COMT活性荧光检测方法,以及基于液相-荧光(LC-FD)的COMT活性高灵敏度检测方法,并在此基础上分别开展了COMT活性的种属差异评价以及个体红细胞中COMT活性的定量评估等应用研究。具体研究内容及结果如下:(1)基于酶标仪高通量检测的COMT活性荧光检测方法的构建及COMT活性种属差异研究。首先,以COMT荧光底物(3-BTD)为核心,借助体外COMT代谢研究技术体系,在酶标仪上构建COMT活性高效评价方法,完成COMT检测相关条件优化以及液相方法的方法验证,以确保评价结果的准确与可靠。其次,利用该评价方法研究了人与七种实验动物(包括猴子、狗、小鼠、大鼠、小型猪、豚鼠和新西兰兔)的肝脏S9中COMT的种间差异。结果表明,来自不同实验动物的所有肝S9均可以催化3-BTD甲基化,但反应速率显示出显著差异。此外还观察到了托卡朋(COMT抑制剂阳性对照)对各种实验物种中3-BTD甲基化的不同作用。确定了不同动物的肝脏S9中3-BTD甲基化的表观动力学参数和固有清除率(Clint),催化效率依次为RLS9>DLS9≈PLS9>MLS9>CyLS9>RaLS9>GpLS9>HLS9。以上发现对于靶向COMT治疗药物的开发,以及探索不同动物模型中COMT相关的生物学功能等具有重要意义。(2)基于LC-FD检测的COMT活性高灵敏度分析方法的构建及个体红细胞中COMT活性评价研究。为解决临床样品分析中高稳定性与高灵敏度要求,本课题以COMT荧光底物(3-BTD)为核心,开发了高选择性、高稳定性、高灵敏度的液相-荧光(LC-FD)检测方法,并用于个体红细胞以及细胞制剂等复杂生物体系中COMT活性的高灵敏检测。结果表明,不同个体红细胞中COMT活性具有5倍差异。该检测方法在准确测定复杂生物样品中COMT的活性方面具有巨大的潜力,有助于深入开展人体COMT生物学功能及其相关疾病的发生发展机制与诊疗等研究。综上所述,本论文立足于当前COMT活性检测所面临的切实问题,以前期自主研发的首个双光子COMT荧光底物(3-BTD)为核心,针对不同的研究对象和实验目的,分别构建了基于酶标仪高通量检测的COMT活性荧光检测方法,以及基于液相-荧光(LC-FD)的COMT活性高灵敏度高准确性检测方法,并在此基础上分别开展了COMT活性的种属差异评价以及个体红细胞中COMT活性的定量评估等应用研究。本研究不仅为复杂体系中COMT活性检测提供了行之有效的方法及实验依据,还为靶向COMT的治疗药物开发以及探索COMT生物学功能及其相关疾病的发生发展机制等研究提供新方法。