第一部分PARP1参与新生小鼠心脏再生和心肌细胞增殖背景:成年哺乳动物心脏在受到损伤时不能再生,结果导致瘢痕修复和心脏重塑。而低等脊椎动物如斑马鱼的心脏能够终身保持再生能力,常用作研究心脏再生的动物模型,但是其应用受到种属进化差距较大的影响。最近研究发现新生小鼠心脏也能够再生,这为心脏再生的研究开辟了一条更为方便的道路。PARP1作为一种存在于细胞核内的蛋白修饰酶,其在心脏发育和心肌细胞肥大中都有重要作用,然而在心脏再生过程中却还没有研究。方法:取不同发育时间点的小鼠心脏组织,用蛋白免疫印迹、q PCR、组织免疫荧光和免疫共沉淀等方法检测心肌细胞增殖情况和PARP1活性及PARP1表达的变化。将出生后1天的小鼠心脏的冠脉左前降支结扎,造成心肌梗死后的心脏再生模型。用组织免疫荧光共染增殖指标Brd U或p H3与心肌细胞标志c TNT,评价心肌细胞增殖情况,用心脏超声,组织Masson染色等评价心脏再生情况以验证模型的有效性。用同样的方法对比PARP1敲除小鼠与野生型小鼠心脏再生能力及心肌细胞增殖能力的差异。通过WGA染色显示的心肌细胞横截面积和心重体重比综合评估生理状态下成年小鼠心脏的心肌细胞数目,并比较PARP1敲除小鼠和野生型小鼠的差别。用同样的方法观察PARP1抑制剂对小鼠心脏再生和心肌细胞增殖的影响。分离乳鼠心肌细胞,用细胞免疫荧光共染增殖指标和心肌细胞标志的方法检测PARP1敲低和PARP1活性抑制对心肌细胞增殖的影响。结果:PARP1活性和表达水平随心肌细胞增殖能力的下降而下降。新生小鼠在LAD结扎后显示出心肌细胞增殖和心脏的再生,表明模型有效。与野生型小鼠相比,PARP1敲除的新生小鼠在LAD结扎后心肌细胞增殖水平降低,表现为Brd U阳性心肌细胞和p H3阳性心肌细胞比例降低,而再生修复没有差异,即心脏纤维化和心功能没有变化。此外,在生理状况下,PARP1敲除也能够减少成年小鼠心肌细胞数量,即抑制了心肌细胞增殖。用PARP1活性抑制剂能够抑制新生小鼠心脏再生和心肌细胞增殖。在体外细胞实验中,PARP1敲低和抑制PARP1活性都能够抑制心肌细胞的增殖。结论:PARP1在新生小鼠心脏再生和心肌细胞增殖过程中起重要作用,其机制可能与PARP1调节心肌细胞周期有关。第二部分过表达PARP1促进心肌细胞增殖和心脏再生背景:急性心肌梗死导致的心力衰竭是危害人群健康的常见疾病,而通过促进心脏再生达到心脏完全修复心脏的目的是令人兴奋的治疗方式。以往促进心脏再生的方式主要关注于干细胞移植,但是其结果一直不能令人满意。而最近的许多研究开始关注于通过促进心肌细胞增殖来促进心脏再生。前面结果我们已经证明了PARP1参与心脏的再生和心肌细胞的增殖,这部分研究关注于PARP1在促进心肌细胞增殖和心脏再生方面的作用。方法:分离出生1天的乳鼠心肌细胞,用腺病毒过表达PARP1并检测心肌细胞增殖情况。心肌细胞增殖的检测通过细胞免疫荧光共染增殖标志如Ed U,Ki67,p H3,Aurora B和心肌细胞标志Actn2。心肌细胞的大小通过心肌细胞的染色面积和心肌细胞核的数目的比值计算。心肌细胞凋亡情况通过TUNEL染色分析。分离乳鼠出生后7天相对成熟的心肌细胞,同样过表达PAPR1后检测其细胞增殖情况。构建PARP1过表达腺相关病毒,在成年小鼠心肌梗死模型中验证其对心脏再生和心肌细胞增殖的作用。心脏再生的评价用心脏的Masson染色和心脏超声,心肌细胞增殖的评价用组织免疫荧光共染增殖指标Brd U和心肌细胞标志c TNT。结果:在出生1天的乳鼠心肌细胞过表达PARP1能够增加Ed U,Ki67,p H3和Aurora B阳性心肌细胞的比例,即促进了心肌细胞的增殖。同时其并不导致心肌细胞面积的增大和心肌细胞凋亡的增多。同样的在出生后7天的乳鼠心肌细胞中过表达PARP1也能增加Ed U和Ki67阳性心肌细胞的比例。在成年心肌梗死的小鼠心脏中过表达PARP1能够改善心脏的修复和心脏功能,也能够增加Brd U阳性的心肌细胞数目。结论:PARP1能够促进乳鼠心肌细胞增殖以及成年小鼠心肌梗死后心脏再生和心肌细胞增殖。第三部分PARP1通过调节Hand2活性影响心肌细胞增殖背景:前面的研究已经证明PARP1能够促进心肌细胞的增殖,然而其作用机制仍不清楚。由于PARP1是一种核蛋白,其发挥功能的主要方式之一是转录调控,而心肌细胞发育相关的转录因子在细胞核内并参与调控心肌细胞增殖,因此我们推测PARP1可能通过某个心脏转录相关因子发挥其促进心肌细胞增殖的作用。方法:在乳鼠心脏组织中用免疫共沉淀的方法寻找PARP1可能的相互作用目的蛋白。在293T细胞中过表达两个目的蛋白,再用免疫共沉淀的方法验证其相互作用。将PARP1质粒按功能区分割为不同的片段,用GST融合蛋白沉降技术分别与目的蛋白孵育验证其相互结合片段。293T细胞中过表达Hand2并进行免疫共沉淀,Western blot显示其PAR修饰水平,验证Hand2被PAR修饰的情况。用双荧光素酶报告基因的方法验证PARP1对目的蛋白转录功能的影响。在体外分离的乳鼠心肌细胞中用细胞免疫荧光染色的方法验证敲低目的蛋白对PARP1促心肌细胞增殖作用的影响。结果:在乳鼠心脏组织中PARP1能够与心脏发育相关的转录因子Hand2结合,其相互作用在239T细胞中也得到了验证。进一步研究发现PARP1的DNA结合区域能够与Hand2结合。Hand2能够被PAR修饰,且抑制PARP1活性后其PAR修饰减少。抑制PARP1活性能够降低Hand2的转录活性,而过表达PARP1能够增加其转录活性。在体外分离的乳鼠心肌细胞中敲低Hand2能够抑制PARP1的促心肌细胞增殖的作用。结论:PARP1能够结合且通过PAR修饰Hand2,并促进其转录活性。PARP1促心肌细胞增殖的作用部分通过Hand2实现。