人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)属于疱疹病毒β亚科，是先天感染所致先天畸形和出生缺陷的首要因素，可引起人类机体广泛的、持续性的感染，其危害巨大。越来越多的研究表明HCMV基因的转录产物在其感染与致病过程中发挥着重要作用，尤其是涉及microRNA（miRNA）的基因转录后调控可能起到更为重要的作用。　　 miRNA是一类长约19-24个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，miRNA具有茎环结构，在不同物种间具有保守性。成熟的miRNA通过miRNA诱导的基因沉默复合物（miRNA-induced gene silencing complex，miRISC）与靶mRNA的3’非翻译区序列（untranslated regions，UTRs）结合发挥对蛋白质翻译的抑制或对靶mRNA的降解作用[1]。2004年，在病毒中首次发现了miRNA的存在，之后在人巨细胞病毒中陆续发现了19种miRNA[2]。最新研究数据显示某些HCMV miRNA参与病毒的复制，在决定病毒感染周期方面发挥重要作用[3-5]。Stern-Ginossar等人研究发现miR-US25-2可减少HCMV及其它DNA病毒的复制和DNA合成，并提出假设认为miR-US25-2可能作用于宿主细胞中与病毒生长相关的靶基因[3]。然而，其作用机制尚不明确。　　 miR-US25-2编码基因位于HCMV US24和US26之间的基因区域，成熟体有miR-US25-2-5p和miR-US25-2-3p两种形式。本研究的目的在于探讨miR-US25-2-3p在HCMV复制中的作用及其作用机制。本研究拟采用本实验室创立的一种新的快速有效的miRNA靶基因筛查方法，即Hybrid-PCR方法[6]筛选miR-US25-2-3p候选靶基因;并在验证miR-US25-2-3p对HCMV复制作用基础上，通过生物信息学分析结合分子生物学方法进一步揭示与HCMV病毒复制相关的miR-US25-2-3p候选靶基因并探讨其调控机制，从靶基因角度初步阐明miR-US25-2-3p过表达抑制HCMV病毒复制的分子机制，为全面理解miR-US25-2-3p的生物学功能提供新的线索。　　 材料与方法：　　 一、实验材料　　 1、HCMV临床分离株H　　 2、人胚肾HEK293细胞、人胚肺成纤维细胞MRC-5　　 3、核酸提取相关试剂　　 4、荧光定量PCR检测相关试剂　　 5、构建表达载体相关试剂　　 6、双萤光素酶报告基因检测相关试剂　　 7、Western blot印迹杂交相关试剂　　 8、MTT检测相关试剂　　 9、常用实验设备包括荧光分光光度计、紫外分光光度计、酶标仪、流式细胞仪、自动凝胶成像分析仪、全温振荡培养箱等。　　 10、常用数据库及分析软件包括基因组数据库、凝胶成像及扫描分析软件、引物设计软件(Primer5)、SPSS version13.0等。　　 二、实验方法　　 1、Hybrid-PCR方法筛查HCMV感染早期人胚肺细胞中miR-US25-2-3p的候选靶基因。　　 2、双萤光素酶报告基因检测系统初步验证miR-US25-2-3p对Hybrid-PCR方法获得的候选靶基因3’-UTR的结合能力，并确立与病毒复制相关miR-US25-2-3p候选靶基因。　　 3、定量PCR(qPCR)方法检测体外过表达miR-US25-2-3p对HCMV DNA复制的影响。　　 4、构建真核翻译起始因子eIF4A13’-UTR野生型和突变型萤光素酶报告基因表达载体，应用双萤光素酶报告基因检测系统检测miR-US25-2-3p对eIF4A13’-UTR的直接结合作用。　　 5、应用Western Blot检测过表达miR-US25-2-3p对MRC-5细胞内源性eIF4A1蛋白表达的影响。　　 6、应用qPCR方法检测miR-US25-2-3p靶向调控eIF4A1表达对HCMV感染的MRC-5细胞内病毒DNA复制的作用。　　 7、萤光素酶报告体翻译分析实验检测miR-US25-2-3p靶向调控eIF4A1表达对MRC-5细胞蛋白质翻译的作用　　 8、MTT实验检测miR-US25-2-3p靶向调控eIF4A1表达对MRC-5细胞增殖的作用。　　 9、基因组DNA定量分析检测miR-US25-2-3p靶向调控eIF4A1表达对MRC-5细胞基因组DNA合成的作用。　　 结果：　　 一、Hybrid-PCR方法筛选miR-US25-2-3p候选靶基因　　 通过Hybrid-PCR成功获得68个含有miR-US25-2-3p候选靶基因信息的序列。共获得17个miR-US25-2-3p候选靶基因。其中1个候选基因为HCMV基因，其余16个候选基因为人类基因组基因。　　 二、候选靶基因3’-UTR结合位点初步鉴定　　 选取5个功能明确的候选靶基因构建了pMIR-REPORT-3’-UTR表达载体，双萤光素酶报告基因活性检测结果显示miR-US25-2-3p对5个候选靶基因3’-UTR区均具有直接结合作用，其中与病毒复制相关的候选靶基因eIF4A13’-UTR区结合miR-US25-2-3p的能力最强。　　 三、体外过表达miR-US25-2-3p抑制HCMV DNA复制　　 qPCR检测HCMV DNA拷贝数实验结果显示体外过表达miR-US25-2-3p能显著降低HCMV DNA复制（P＜0.01）。　　 四、eIF4A1是miR-US25-2-3p的直接靶基因　　 双萤光素酶报告基因检测结果显示，在人胚肺成纤维细胞MRC-5中，共转染pMIR-eIF4A13’-UTR重组质粒和miR-US25-2-3p组的报告基因活性较对照组明显降低，P＜0.05。Western blot结果显示，与对照组相比，转染了miR-US25-2-3p的MRC-5细胞中eIF4A1表达量明显下调。　　 五、miR-US25-2-3p靶向作用eIF4A1抑制HCMV复制　　 qPCR检测HCMV DNA拷贝数实验结果显示miR-US25-2-3p过表达和eIF4A1siRNA介导的eIF4A1表达抑制能明显降低HCMV感染后的MRC-5细胞内HCMV DNA的合成(P＜0.01)。　　 六、miR-US25-2-3p靶向作用eIF4A1对MRC-5细胞生物学功能的影响　　 萤火虫萤光素酶报告体细胞翻译分析结果显示miR-US25-2-3p过表达，以及eIF4A1 siRNA介导的eIF4A1表达抑制能明显抑制宿主MRC-5细胞蛋白质翻译(P＜0.01);MTT结果表明与对照组相比，转染pre-miR-US25-2-3p和eIF4A1 siRNA的MRC-5细胞显示出明显的生长抑制;而且，外源性miR-US25-2-3p过表达和eIF4A1 siRNA体外转染均可显著降低MRC-5细胞的基因组DNA的合成。　　 结论：　　 1、miR-US25-2-3p通过与真核翻译起始因子eIF4A13’-UTR区特定基序靶向结合负性调控该基因的表达。　　 2、miR-US25-2-3p通过靶向作用eIF4A1抑制HCMV DNA复制。　　 3、miR-US25-2-3p通过靶向作用eIF4A1抑制宿主MRC-5细胞的蛋白质翻译、细胞增殖和基因组DNA合成。