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猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)感染猪引起的一种重大烈性传染病。研究表明,CSFV p7蛋白能够在细胞膜上形成离子通道和胞质环,与CSFV复制过程中离子通道的形成有关。此外,CSFV p7蛋白能够被宿主蛋白酶体降解,通过激活caspase1诱导炎症因子IL-1β的分泌,从而进一步引起宿主细胞的免疫应答。为了构建重组诱饵质粒pGBKT7-p7,我们首先利用RT-PCR技术扩增获得CSFV p7基因,将CSFV p7基因克隆至酵母双杂交系统诱饵载体pGBKT7中,获得了重组诱饵质粒pGBKT7-p7,经PCR鉴定、基因序列测定无误后,将重组质粒pGBKT7-p7转化至酵母细胞Y2HGold,检测其对酵母的毒性作用、自激活作用及蛋白表达情况,同时设立pGBKT7空载对照和自激活对照。结果显示,Western blot可检测到分子量大小约35 kDa的条带,与预期p7蛋白大小相符。Y2HGold(pGBKT7-p7)和Y2HGold(pGBKT7)在SD/-Trp平板上菌落生长情况基本一致,Y2HGold(pGBKT7-p7)在SD/-Trp/X平板上生长且为白色菌落,在SD/-Trp/X/Aba平板上不生长,表明重组诱饵质粒pGBKT7-p7能在酵母菌中表达且对酵母菌无毒性作用和自激活作用。为了研究CSFV p7蛋白与宿主细胞蛋白之间的相互作用关系,我们将重组诱饵质粒pGBKT7-p7与本实验室构建的猪外周血单核细胞cDNA文库进行酵母杂交,筛选到7个与CSFV p7蛋白有潜在相互作用的宿主细胞蛋白,分别是蛋白酶体成熟蛋白(POMP)、微管相关蛋白EB1(MAPRE1)、线粒体电压依赖性阴离子通道蛋白1(VDAC1)、活化STAT1的蛋白抑制剂(PIAS1)、配子生成素结合蛋白2(GGNBP2)、COP9信号复合体2亚基蛋白(COSP2)、接触蛋白1(CNTN1)。经过蛋白功能分析,发现这7个蛋白分别参与泛素蛋白酶体系统、线粒体自噬、抗原呈递处理、免疫应答、胞内物质运输、信号转导、离子交换、病毒的复制繁殖等过程。研究表明,MAPRE1作为微管相关蛋白,在反转录病毒基因整合至宿主细胞基因组的过程中起到重要调控作用,与病毒的复制密切相关;VDAC1作为电压依赖性阴离子通道蛋白,能够通过与病毒蛋白相互作用或改变自身表达水平调控病毒的复制。为了验证细胞MAPRE1、VDAC1蛋白与CSFV p7蛋白的直接相互作用关系,我们将携带MAPRE1、VDAC1基因的重组质粒p3×flag-MAPRE1、p3×flag-VDAC1转染HEK293T细胞,并进行GST pulldown处理。结果显示,p3×flag-MAPRE1、p3×flag-VDAC1转染的细胞进行GST pulldown处理后均可检测到分子量大小约35kDa的蛋白条带,与预期MAPRE1、VDAC1蛋白大小相符。表明细胞MAPRE1、VDAC1蛋白与CSFV p7蛋白之间存在直接的相互作用。为了进一步验证细胞MAPRE1、VDAC1蛋白与CSFV p7蛋白的相互作用关系,我们将携带MAPRE1、VDAC1的重组质粒p3×flag-MAPRE1、p3×flag-VDAC1与pEGFP-p7共转染HEK293T细胞,进行免疫共沉淀。结果显示,p3×flag-MAPRE1、p3×flag-VDAC1转染的细胞进行免疫共沉淀后均可检测到分子量大小约35kDa的蛋白条带,与预期MAPRE1、VDAC1蛋白大小相符。表明细胞MAPRE1、VDAC1蛋白与CSFV p7蛋白之间存在相互作用。综上所述,本研究从猪外周血单核细胞cDNA文库筛选出了7个与CSFV p7蛋白有潜在相互作用的宿主细胞蛋白,并进一步验证了细胞MAPRE1、VDAC1蛋白与CSFV p7蛋白之间的相互作用,为研究CSFV p7与宿主细胞蛋白的作用奠定基础,为深入研究CSFV复制机制提供科学依据。