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研究背景缺血性心脏病是危害人类健康的主要疾病之一,其发病率及死亡率高。心肌缺血是由于冠状动脉粥样硬化、痉挛、栓塞等引起心肌缺血缺氧的病理生理状态。心肌缺血再灌注损伤是冠状动脉部分或完全急性梗阻之后,在一定时间内重新获得再通,缺血的心肌虽然得以恢复灌注,但是再次灌注后反而会加重心肌的损伤,针对心肌缺血再灌注损伤,目前治疗策略主要包括药物干预、缺血预适应和缺血后适应,但效果并不理想。因此,进一步研究其作用机制极为重要。铁死亡是一种铁依赖的,区别于细胞凋亡、坏死和自噬的新近发现的调节性细胞死亡模式。当二价铁或酯氧合酶异常增多时,不饱和脂肪酸发生脂质过氧化,诱导细胞铁死亡。研究表明,铁死亡能诱发肿瘤、脑卒中、肝功能不全、肾功能不全及心肌病等疾病。然而,抑制铁死亡可有效干预相关疾病。目前,铁死亡对急性心肌缺血/再灌注损伤的作用已有报道,但其具体机制仍有待阐明。AMPK是能量感受器,可对细胞的能量变化做出快速应答。研究表明,AMPK参与调节心肌细胞的代谢、氧化应激、炎症、凋亡和自噬等病理生理过程。Nrf2是具有氧化还原强敏感性的转录因子,通过调控Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的表达,改善氧化应激,减少细胞损伤。研究表明,Nrf2被AMPK等上游调控因子激活后,诱导HO-1等下游抗氧化因子的表达。血红素被HO-1分解为亚铁、绿胆素和一氧化碳,抑制其促氧化作用。并且,绿胆素及其代谢产物也具有ROS清除作用。此外,HO-1对急性心肌缺血/再灌注损伤也具有保护作用。有文献报道,靶向激活AMPK/Nrf2/HO-1通路对胚胎成纤维细胞、肝脏、神经系统和呼吸系统等疾病具有保护作用。芹菜素,是一种黄酮类化合物,广泛分布于蔬菜和水果中,尤以芹菜中含量较高。芹菜素具有显著的抗氧化、抗炎、抗病毒及抑癌作用。研究表明,芹菜素可以减轻内毒素引起的心肌毒性及链脲佐菌素引起的糖尿病心肌病,抑制TGF-β1刺激的心脏成纤维细胞分化和细胞外基质产生。芹菜素在体外通过激活AMPK和ERK通路减轻肾成纤维细胞;芹菜素表现出多发性骨髓瘤细胞系的细胞毒性。然而,芹菜素能否通过激活AMPK/Nrf2/HO-1信号通路改善急性心肌缺血/再灌注损伤,目前尚未有报道。因此,深入研究芹菜素对急性心肌缺血/再灌注损伤的作用机制可为芹菜素的潜在临床应用提供实验依据和理论基础。综上所述,本文通过构建H9c2心肌样细胞急性缺氧/复氧模型和SD大鼠心肌急性缺血/再灌注模型,分别在细胞和动物水平对AMPK/Nrf2/HO-1信号通路介导芹菜素的作用进行探讨。我们提出:芹菜素可能通过激活AMPK/Nrf2/HO-1信号通路发挥抗心肌缺血/再灌注损伤作用,而且损伤过程有铁死亡的参与。第一部分芹菜素介导AMPK/Nrf2/HO-1信号通路在H9c2心肌样细胞缺氧/复氧损伤中的保护作用及机制研究研究目的1.探讨芹菜素对H9c2心肌样细胞急性缺氧/复氧损伤是否具有保护作用。2.探讨H9c2心肌样细胞急性缺氧/复氧损伤过程是否有铁死亡的参与。3.探讨芹菜素是否通过激活AMPK/Nrf2/HO-1信号通路改善铁死亡参与的H9c2心肌样细胞急性缺氧/复氧损伤。研究方法1.培养H9c2心肌样细胞,构建缺氧/复氧模型。2.根据处理方式不同,将H9c2心肌样细胞分成6组:（1）正常对照组,（2）缺氧/复氧组,（3）缺氧/复氧+芹菜素组,（4）缺氧/复氧+Fer-1组,（5）缺氧/复氧+芹菜素+ML385组,（6）缺氧/复氧+芹菜素+Compound C组。缺氧3h,复氧2h。其中,Fer-1为铁死亡抑制剂,ML385为Nrf2的抑制剂,Compound C为AMPK抑制剂。3.观察不同浓度的芹菜素对H9c2心肌样细胞缺氧/复氧的影响,分为7组:（1）正常对照,（2）缺氧/复氧,（3）缺氧/复氧+芹菜素（5μM）,（4）缺氧/复氧+芹菜素（10μM）,（5）缺氧/复氧+芹菜素（20μM）,（6）缺氧/复氧+芹菜素（40μM）,（7）缺氧/复氧+芹菜素（80μM）。H9c2心肌样细胞缺氧/复氧前24h加入不同浓度的芹菜素处理,观察各组细胞的存活率和培养液中LDH活性,筛选出最佳的芹菜素作用浓度。4.采用透射电镜观察H9c2心肌样细胞的形态。5.流式细胞仪检测H9c2心肌样细胞的凋亡情况及ROS水平。6.CCK-8试剂盒检测H9c2心肌样细胞的活力。7.酶标仪检测乳酸脱氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶及Caspase 3的活性,酶标仪检测检测丙二醛、Fe2+、还原型谷胱甘肽及氧化型谷胱甘肽含量。8.用酶联免疫法吸附法（Elisa法）检测AMP/ATP比值。9.采用Ca2+诱导酶标法测线粒体通透性转换孔的开放程度。10.通过荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-q PCR）检测各组H9c2心肌样细胞PTGS2 m RNA水平。11.Western blot检测各组H9c2心肌样细胞NOX4、GPX4、NDUFB8、UQCRC2、m TOR、Nrf2、GSK3β、HO-1及AMPKα2蛋白表达水平。研究结果1.20μM芹菜素显著提高细胞存活率,降低LDH活性,同时不具有细胞毒性。因此,选取20μM作为最佳浓度。2.细胞损伤指标:H9c2心肌样细胞急性缺氧/复氧模型中,芹菜素和Fer-1预处理增加H9c2心肌样细胞活力,降低LDH含量。Compound C和ML385可削弱芹菜素的保护作用。3.通路蛋白的表达:H9c2心肌样细胞急性缺氧/复氧模型中,芹菜素预处理显著上调AMPKα2、GSK3β、Nrf2及HO-1的表达,下调m TOR的表达。然而,芹菜素的上述作用均被Compound C和ML385逆转。此外,Fer-1预处理表现出类似芹菜素的效应。4.氧化应激指标:H9c2心肌样细胞急性缺氧/复氧模型中,芹菜素和Fer-1预处理显著降低ROS生成和MDA含量,增加SOD、CAT、GSH-Px活性和GSH/GSSG比值,促进了Nrf2的细胞核移位,使细胞质Nrf2水平降低,细胞核Nrf2水平增加。加入Compound C和ML385处理后明显抑制了芹菜素的上述作用。5.线粒体功能指标:H9c2心肌样细胞急性缺氧/复氧模型中,加入芹菜素和Fer-1预处理后,线粒体通透性转换孔开放降低,线粒体膜电位增加,NDUFB8和UQCRC2表达增加,ATP生成增多,AMP/ATP比值减少。然而,加入Compound C和ML385后芹菜素的作用被削弱。6.凋亡指标:H9c2心肌样细胞急性缺氧/复氧模型中,芹菜素和Fer-1预处理显著减少了细胞凋亡率和caspase 3活性,而Compound C和ML385明显削弱了芹菜素这种保护作用。7.透射电镜结果:Control组细胞线粒体大小正常,嵴结构完整。A/R组线粒体皱缩,线粒体嵴排列紊乱,表现出鲜明的铁死亡特征。芹菜素和Fer-1预处理显著改善了急性A/R损伤诱导的线粒体形态变化。随着Compound C和ML385的加入,进一步加重了线粒体及其嵴的损伤。8.铁死亡指标:H9c2心肌样细胞急性缺氧/复氧模型中,芹菜素和Fer-1预处理后,Fe2+含量和PTGS2 m RNA水平明显降低,NOX4表达减少,GPX4表达增加。加入Compound C和ML385处理后,芹菜素的上述作用被逆转。研究结论1.H9c2心肌样细胞急性A/R损伤是多种调节性细胞死亡模式共同作用的结果。芹菜素具有多机制多靶点,可通过抑制铁死亡和凋亡改善细胞急性A/R损伤。2.H9c2心肌样细胞急性A/R损伤有铁死亡的参与,而且Fer-1可显著降低这种损伤。3.H9c2心肌样细胞急性A/R损伤中,芹菜素可通过激活AMPK/Nrf2/HO-1信号通路发挥显著的抗铁死亡作用。第二部分芹菜素介导AMPK/Nrf2/HO-1信号通路在心肌缺血再灌注损伤中的保护作用及机制研究通过第一部分对H9c2心肌样细胞急性缺氧/复氧损伤的研究,我们明确了在细胞水平芹菜素通过激活AMPK/Nrf2/HO-1信号通路改善铁死亡引起的H9c2心肌样细胞急性缺氧/复氧损伤。但是在动物水平是否具有一致性,尚需进一步验证。因此,在第二部分我们采用SD大鼠作为研究对象,构建动物水平的缺血/再灌注损伤模型,通过检测相关指标来验证是否与细胞水平存在差异性。研究目的1.在动物水平验证芹菜素对心肌缺血/再灌注损伤是否具有保护作用。2.在动物水平验证心肌缺血/再灌注损伤过程是否有铁死亡参与。3.在动物水平验证芹菜素是否通过激活AMPK/Nrf2/HO-1信号通路改善铁死亡参与的心肌缺血/再灌注损伤。研究方法1.构建缺血/再灌注损伤模型,将SD大鼠随机分成6组:（1）正常对照组,（2）缺血/再灌注组,（3）缺血/再灌注+芹菜素组,（4）缺血/再灌注+Fer-1组,（5）缺血/再灌注+芹菜素+ML385组,（6）缺血/再灌注+芹菜素+Compound C组。缺血30min,再灌注3h。2.TTC染色法检测心肌的梗死面积。3.采用透射电镜观察心肌的超微结构。4.TUNEL试剂盒检测心肌细胞的凋亡情况。5.采用DHE探针检测心肌细胞的ROS生成量。6.酶标仪检测LDH、SOD、GSH-Px、CAT及Caspase 3活性,检测MDA、Fe2+含量及GSH/GSSG比值。7.用酶联免疫法吸附法（Elisa法）检测AMP/ATP比值。8.采用Ca2+诱导酶标法测线粒体通透性转换孔的开放程度。9.通过荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-q PCR）检测心肌细胞的PTGS2m RNA水平。10.Western blot检测心肌细胞NOX4、GPX4、NDUFB8、UQCRC2、m TOR、Nrf2、GSK3β、HO-1、AMPKα2蛋白的表达水平。研究结果1.急性心肌缺氧/复氧后,心肌梗死面积显著增加,血清IL-6、TNF-α、CK-MB、CTNI含量及MPO、LDH活性增加,表明急性心肌I/R损伤模型构建成功。芹菜素和Fer-1预处理显著减小心肌梗死面积,降低IL-6、TNF-α、CK-MB、CTNI含量及MPO、LDH活性。然而,Api的心肌保护作用被Compound C和ML385削弱。2.通路蛋白的表达:急性心肌缺血/再灌注模型中,芹菜素和Fer-1预处理显著上调AMPKα2表达,同时增加GSK3β、Nrf2、HO-1表达,减少m TOR表达,提示AMPK/Nrf2/HO-1通路蛋白可被芹菜素激活。且Fer-1与芹菜素表现出相似的调节作用。然而,芹菜素的上述作用可被Compound C和ML385显著削弱。3.氧化应激指标:急性心肌缺血/再灌注模型中,芹菜素和Fer-1预处理明显减少ROS生成,增加SOD、CAT及GSH-Px活性,增大GSH/GSSG值,减少MDA含量。减少细胞质Nrf2表达,促进细胞核Nrf2积累。Compound C和ML385使上述芹菜素的作用被逆转。4.线粒体功能指标:急性心肌缺血/再灌注模型中,芹菜素和Fer-1预处理明显细胞增加ATP含量,降低AMP/ATP比值,上调NDUFB8和UQCRC2的表达,Compound C和ML385明显逆转了芹菜素的上述作用。5.凋亡指标:急性心肌I/R损伤后,细胞凋亡数量和Caspase 3活性显著增加,经过芹菜素和Fer-1预处理,细胞凋亡数量和Caspase 3活性显著减少,然而Compound C和ML385明显了削弱芹菜素的作用。6.透射电镜结果:正常对照组心脏线粒体乳头肌大小正常,排列整齐,线粒体嵴结构完整,心肌闰盘排列整齐。缺血/再灌注组闰盘结构不完整,可见断裂,线粒体缩小,线粒体嵴减少或消失,是鲜明的铁死亡形态特征。芹菜素和Fer-1预处理显著改善了上述心肌I/R损伤。然而,Compound C和ML385削弱了芹菜素的保护作用。7.铁死亡指标:急性心肌缺血/再灌注处理明显增加Fe2+含量和PTGS2m RNA水平,上调NOX4表达,下调GPX4表达。芹菜素和Fer-1预处理后,Fe2+含量和PTGS2 m RNA水平明显降低,NOX4表达减少,GPX4表达增加。加入Compound C和ML385处理逆转了芹菜素的上述作用。研究结论1.急性心肌I/R损伤是多种调节性细胞死亡模式共同作用的结果,芹菜素具有多机制多靶点,可通过抑制铁死亡和凋亡改善急性心肌I/R损伤。2.急性心肌I/R损伤有铁死亡的参与,且Fer-1可显著降低这种损伤。3.芹菜素通过激活AMPK/Nrf2/HO-1信号通路改善铁死亡参与的急性心肌I/R损伤。