食管癌作为我国最常见的恶性肿瘤之一,2015年预计食管癌新发病率在所有中居第3位,其中男性发病率为320.8/10万,女性为157.2/10万,预计死亡率居第4位,其中男性253.8/10万,女性121.3/10万,因而,食管癌的临床防治仍然任重而道远。随着肿瘤学、放疗、介入治疗、热疗、生物免疫治疗等多学科治疗的临床协作模式不断成熟,食管癌的综合治疗也取得了巨大的进展,但其治愈率和5年生存率仍然令人失望。研究表明,导致食管癌治疗不理想的主要原因之一就在于食管癌增殖和凋亡异常,进而促进复发转移,因而深入阐明食管癌的增殖和凋亡机制,筛选并鉴定有效的靶点和特异性的抑制剂,探究如何联合放化疗能进一步提高食管癌患者的生存获益,都是目前食管癌基础研究和临床研究的热点和难点。近年来,随着对肿瘤分裂增殖机制研究的不断深入,骨架动力蛋白系统在肿瘤发病和耐药机制中的研究引起了人们的关注,尤其是肿瘤细胞中微管依赖的驱动蛋白(Kinesin)超家族,越来越多研究证实Kinesin蛋白家族参与调控细胞膜性细胞器的运输、基因翻译和蛋白运输,细胞信号通路转导等,能影响星形胶质细胞和肿瘤细胞的周期和凋亡,在有丝分裂中发挥关键作用,参与并促进肿瘤的发生发展。因此,深入探究食管癌增殖的机制,阐明Kinesin家族在食管癌发生和进展中的作用,筛选并鉴定有效的靶点,为进一步提高食管癌的疗效提供新的思路和依据。Kinesin家族结构上主要有氨基酸序列和微管结合域两大部分构成,由于微管结合域的序列不同,导致其功能也不尽相同,主要分成14个亚型,分别是Kinesin-1~14。根据不同亚型的功能主要分为两大类:一类是功能保守的亚族,主要介导细胞器和囊泡的运输;另一类亚型主要介导有丝分裂,尤其是在维持细胞有丝分裂器纺锤体功能发挥重要作用。Kinesin-1主要参与分离染色体和聚焦双极纺锤体,在有丝分裂早期发挥关键的调控作用,而胞质的分离依赖于Kinesin-12磷酸化(KIF-15)的参与,从而影响有丝分裂的进程、细胞增殖和凋亡。研究表明KIF-15对星性胶质细胞增殖与调亡具有重要意义,敲除KIF-15的表达能显著抑制细胞的增殖和促进凋亡。近年来。学者提出KIF-15作为一个重要的致癌基因的观点,但有关KIF-15在食管鳞癌中的表达及其在食管癌细胞发生发展中的作用,尚未见相关报道。我们前期预实验表明KIF-15在食管鳞癌中高表达,可能参与食管鳞癌的发生发展,本研究旨在进一步探究KIF-15在食管鳞癌发生和进展中的作用,为阐明食管鳞癌的发病机制提供新的思路,并鉴定KIF-15能否作为食管鳞癌潜在的新的治疗靶点。本课题首先采用免疫组化、Western blot、Real time-PCR的方法检测了50例食管鳞癌及其对应的癌旁组织中KIF-15蛋白和mRNA的表达,并分析KIF-15蛋白的表达与食管癌临床病理参数之间的关系,Kaplan-Meier生存分析探究KIF-15蛋白表达与食管癌预后的关系,初步阐明KIF-15是否介导人食管鳞癌的发生发展,能否作为食管鳞癌不良预后的潜在靶标;体外实验部分,构建重组慢病毒表达载体GV115/KIF-15 shRNA,制备重组慢病毒GV115/KIF-15 shRNA,评价感染食管癌细胞Eca-109的效率和重组慢病毒GV115/KIF-15 shRNA的功能,构建Eca109/KIF15~-细胞,为进一步阐明KIF-15在食管癌细胞中的生物学功能提供靶细胞;以Eca109/KIF15~-细胞为研究对象,进一步探究沉默KIF-15基因表达后,对Eca-109细胞的生长、增殖、凋亡、平板克隆形成能力、侵袭转移能力和裸鼠移植瘤生长的影响,体内外实验进一步阐明KIF-15在食管鳞癌中的生物学功能。本课题以KIF-15为研究靶点,旨在探究KIF-15在食管鳞癌发生发展中的作用,主要分以下三个部分:第一部分:人食管鳞癌组织和癌旁组织中KIF-15的表达及临床病理学意义第二部分:重组慢病毒GV115/KIF-15 shRNA的制备和功能测定第三部分:重组慢病毒GV115/KIF-15 shRNA对食管癌细胞Eca-109生物学功能的影响第一部分人食管鳞癌组织和癌旁组织中KIF-15的表达及临床病理学意义材料与方法1.免疫组织化学法检测人食管鳞癌组织和癌旁组织中KIF-15蛋白表达;2.Real time-PCR检测人食管鳞癌组织和癌旁组织中KIF-15 mRNA的表达;3.Western blot检测人食管鳞癌组织和癌旁组织中KIF-15蛋白表达;4.Kaplan-Meier生存曲线分析KIF-15高表达与食管鳞癌病人无进展生存时间的关系;5.统计学处理:所有实验结果的数据均采用SPSS 17.0统计软件包分析处理数据,以均数±标准差(x±s)表示,采用Kaplan-Meier生存分析和log-rank检验分析KIF-15表达与食管癌无疾病进展时间的关系;采用Pearson’sχ2检验比较两分类变量的统计学差异;采用Spearman等级相关分析比较两个有序变量之间的统计学差异,以α=0.05为显著性检验水准。结果1.免疫组织化学法(IHC)检测结果显示:食管鳞癌组织和癌旁组织中KIF-15蛋白表达阳性率分别为66.00%和24.00%(P<0.05)。2.Real time-PCR检测结果显示:食管鳞癌组织和癌旁组织中KIF-15mRNA表达阳性率分别为72.00%和26.00%(P<0.05)。3.Western blot检测结果显示:食管鳞癌组织和癌旁组织中KIF15蛋白表达阳性率分别为58%和18%(P<0.05)。4.在食管鳞癌组织中,根据IHC实验结果,KIF-15蛋白高表达与患者年龄、性别、病灶大小、肿瘤分化程度比较均未见相关性(P>0.05),与TNM分期、淋巴结转移呈正相关关系(P<0.05)。5.Kaplan-Meier生存曲线分析结果表明:KIF-15蛋白阳性表达组与阴性表达组中位PFS分别为9.5月和14.2月(P<0.05),差异有统计学意义,提示KIF-15高表达与食管鳞癌PFS密切相关,提示KIF-15可能是食管癌不良预后的肿瘤生物标志物。第二部分重组慢病毒GV115/KIF-15 shRNA的制备和功能测定材料与方法1.将KIF-15 shRNA寡核苷酸片段退火,产物插入GV115慢病毒表达载体pCMV启动子下游,筛选阳性菌落,构建并鉴定GV115/KIF-15 shRNA慢病毒表达载体。2.采用吉凯公司的二代自失活型慢病毒包装系统在293T细胞中包装慢病毒GV115/KIF-15 shRNA,收集上清液,并用超速离心法进行浓缩与纯化,利用荧光计数仪测定重组慢病毒GV115/KIF-15 shRNA对食管癌细胞Eca-109的感染效率4.Real time-PCR检测重组慢病毒感染Eca109细胞后KIF-15 mRNA的表达,评价重组慢病毒GV115/KIF-15 shRNA的功能;5.Western blot检测重组慢病毒感染Eca109细胞后KIF-15蛋白表达,评价重组慢病毒GV115/KIF-15 shRNA的功能;结果1.酶切鉴定结果及基因测序结果表明成功构建重组慢病毒表达载体GV115/KIF-15 shRNA2.成功包装出慢病毒GV115/KIF-15 shRNA,重组慢病毒GV115/KIF-15shRNA能有效感染食管癌细胞Eca-109。4.重组慢病毒GV115/KIF-15 shRNA感染食管癌细胞Eca-109后,能有效抑制KIF-15 mRNA表达5.重组慢病毒GV115/KIF-15 shRNA感染食管癌细胞Eca-109后,能有效抑制KIF-15蛋白表达第三部分重组慢病毒GV115/KIF-15 shRNA对食管癌细胞Eca-109生物学功能影响材料与方法1.MTT法检测重组慢病毒GV115/KIF-15 shRNA对Eca-109细胞的增殖影响;2.Celigo细胞计数法检测重组慢病毒GV115/KIF-15 shRNA对Eca-109细胞的生长影响;3.Annexin V-APC单染法检测重组慢病毒GV115/KIF-15 shRNA对Eca-109细胞的凋亡影响;4.平板克隆形成实验检测重组慢病毒GV115/KIF-15 shRNA对Eca-109细胞的克隆形成能力影响;5.Transwell法检测重组慢病毒GV115/KIF-15 shRNA对Eca-109细胞的侵袭转移能力的影响;6.重组慢病毒GV115/KIF-15 shRNA对Eca-109细胞移植瘤生长的影响;7.统计学处理:所有实验结果的数据均采用SPSS 17.0统计软件包分析处理数据,以均数±标准差(x±s)表示;采用Pearson’sχ2检验比较两分类变量的统计学差异;采用Spearman等级相关分析比较两个有序变量之间的统计学差异,以α=0.05为显著性检验水准。结果1.与对照组相比,重组慢病毒GV115/KIF-15 shRNA敲低KIF-15表达,能有效抑制Eca-109细胞的增殖(P<0.05):2.与对照组相比,重组慢病毒GV115/KIF-15 shRNA敲低KIF-15表达,能有效抑制Eca-109细胞的生长(P<0.05):3.与对照组相比,重组慢病毒GV115/KIF-15 shRNA敲低KIF-15表达,能有效促进Eca-109细胞的凋亡(P<0.05):4.与对照组相比,重组慢病毒GV115/KIF-15 shRNA敲低KIF-15表达,能有效抑制Eca-109细胞的克隆形成(P<0.05):5.与对照组相比,重组慢病毒GV115/KIF-15 shRNA敲低KIF-15表达,能有效抑制Eca-109细胞的侵袭(P<0.05):6.与对照组相比,重组慢病毒GV115/KIF-15 shRNA敲低KIF-15表达,能有效抑制Eca-109细胞移植瘤的生长(P<0.05):结论1.人食管鳞癌组织中KIF-15蛋白和mRNA表达均显著高于癌旁组织,蛋白主要定位于胞浆表达,其高表达与患者年龄、性别、病灶大小、肿瘤分化程度相比,均未见相关性,与食管癌TNM分期,淋巴结转移正相关关系,KIF-15蛋白阳性表达组与阴性表达组中位PFS分别为9.5月和14.2月(P<0.05),差异有统计学意义,提示KIF-15高表达与食管鳞癌PFS密切相关,KIF-15可能是食管癌不良预后的潜在肿瘤生物标志物。2.成功构建GV115/KIF-15 shRNA的慢病毒表达载体,成功制备高滴度的重组慢病毒GV115/KIF-15 shRNA,并能有效感染人食管癌细胞系Eca-109;重组慢病毒GV115/KIF-15 shRNA感染食管癌细胞Eca-109后,能显著抑制KIF-15mRNA表达和蛋白表达,成功构建Eca109/KIF-15~-细胞,为后续研究提供靶细胞。3.重组慢病毒GV115/KIF-15 shRNA能有效抑制Eca-109细胞的生长、增殖、克隆形成、侵袭转移和移植瘤的生长,促进Eca109细胞凋亡,体内外试验进一步表明KIF-15可能是食管鳞癌一个潜在的治疗靶点。