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奶牛子宫在分娩后常被病原菌感染,造成奶牛子宫内膜炎,最终对奶牛生产性能产生影响。在致病菌中,一类重要且被广泛研究的细菌是大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)。围产期奶牛因存在多种应激反应,血浆皮质醇(Cortisol,COR)浓度通常升高,高水平COR与子宫内膜抵抗E.coli感染之间具有密切关联,然而其具体机制尚未明确。本研究选用体外培养的奶牛子宫内膜上皮细胞(Bovine endometrial epithelial cells,BEECs)为研究对象,使用E.coli刺激细胞进行造模,探究皮质醇对E.coli诱导的BEECs炎性反应的影响,为奶牛子宫内膜炎的防治提供理论依据。1、皮质醇对LPS、热灭活E.coli或未灭活E.coli诱导的BEECs炎性基因表达变化的影响构建用 1 μg/mL LPS、1 × 108 CFU/mL 热灭活 E.coli或1 × 106 CFU/mL 未灭活 E.coli处理BEECs的炎性反应模型(模型组),或在每一种模型组再加入5、15或30 ng/mLCOR共处理细胞(COR共处理组),分别在处理不同时间后采用qPCR检测细胞炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α以及TLR-4的mRNA相对表达量。结果显示:LPS模型组与对照组相比,其 TLR-4 mRNA 在 6 h 以及 IL-1β、IL-6、IL-8 和 TNF-α mRNA 在 2、6 和 18 h 的相对表达量均增加(p<0.01);与LPS模型组相比,COR共处理组的TLR-4以及上述炎性因子的mRNA表达量均下降(p<0.05);加入热灭活E.coli处理细胞6、18和48 h后,其TLR-4以及上述炎性因子的mRNA相对表达量均高于对照组(p<0.01),与热灭活E.coli模型组相比,加入COR共处理后细胞TLR-4以及上述炎性因子表达量下降(p<0.05);未灭活E.coli处理细胞2、4和6 h后,与对照组相比其IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α mRNA相对表达升高(p<0.01),而TLR-4 mRNA在4和6h出现下降(p<0.01),COR共处理组的上述炎性因子的mRNA表达量均高于未灭活E.coli模型组(p<0.05)。以上结果表明:皮质醇对LPS、热灭活E.coli或未灭活E.coli诱导的BEECs炎性反应相关基因的表达变化具有不同影响。2、皮质醇对热灭活或未灭活E.coli诱导的BEECs NF-κB和MAPK通路变化的影响以1 × 108 CFU/mL热灭活或1 × 106 CFU/mL未灭活的E.coli处理BEECs制作炎性反应模型(模型组),或在每一种模型组再加入5、15或30 ng/mL COR共处理细胞(COR共处理组),分别于处理120或30 min后采用Western blot检测NF-κB和MAPK信号通路关键蛋白的磷酸化水平,并通过免疫荧光染色法观察p65蛋白分布情况。Western blot结果显示:加入热灭活E.coli处理细胞120 min后,NF-κB通路的P-p65与P-IκBα、MAPK通路的P-p38与P-JNK的表达均高于对照组(p<0.01),加入15或30 ng/mLCOR共处理后各蛋白表达均低于该模型组(p<0.05),所有处理组的P-ERK表达均无明显变化;加入未灭活E.coli处理30 min后p65、IκBα p38、JNK和ERK磷酸化水平均高于对照组(p<0.05),15或30ng/mLCOR共处理组的上述各蛋白磷酸化水平均高于该造模组(p<0.05)。免疫荧光染色的结果显示:热灭活E.coli组p65蛋白入核量明显多于对照组和30 ng/mL COR共处理组;未灭活E.coli组p65蛋白入核量也明显多于对照组,但低于30ng/mLCOR共处理组。以上结果表明:皮质醇对热灭活或未灭活E.coli诱导的BEECs NF-κB和MAPK信号通路关键蛋白的表达具有不同调控作用。3、皮质醇和米非司酮共处理对热灭活E.coli诱导的BEECs炎性反应变化的影响以1 × 108 CFU/mL热灭活E.coli处理BEECs制作炎性反应模型,皮质醇组是热灭活E.coli与30 ng/mL COR共处理,RU486组是热灭活E.coli与35 ng/mL糖皮质激素受体抑制剂RU486共处理,共处理组是热灭活E.coli、COR与RU486共处理。处理18 h后检测细胞炎性反应相关物质的基因表达水平,处理120 min后检测NF-κB和MAPK信号通路关键蛋白的表达水平及观察荧光染色p65蛋白分布情况。结果显示:模型组IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 和 TLR-4mRNA 及 P-p65、P-IκBα、P-p38、P-JNK 和 P-ERK 蛋白的相对表达均高于对照组(p<0.01),皮质醇组的各基因及蛋白的表达量均低于模型组(p<0.01);RU486组各基因及蛋白表达量与模型组无显著差异,共处理组的各基因及蛋白相对表达水平高于皮质醇组(p<0.01);与对照组相比,模型组p65蛋白明显入核,皮质醇组细胞核内p65蛋白少于模型组和共处理组,RU486组细胞核内绿色荧光与模型组无显著差异。以上结果表明:皮质醇通过糖皮质激素受体对未灭活E.coli诱导的BEECs炎性反应相关基因和蛋白的表达进行调控。