角膜移植手术是目前世界上最具代表性的器官移植术。在我国，单眼和双眼角膜盲约有400～500万，其中约80％可以通过角膜移植手术脱盲。目前，我国每年约实施5000例角膜移植手术，显而易见，这远远不能满足实际需要。限制手术大量广泛开展的原因，除了供体角膜来源缺乏及中长期保存方法欠缺外，临床眼科医师直接面临的难题，是如何抑制免疫排斥反应，提高角膜移植片的存活率。“低危”角膜进行同种异体角膜移植术后，在经典的类皮质甾酮治疗条件下，大部分植片都能得到存活。但是，这种激素治疗通常会导致青光眼、白内障及机会性感染等并发症的发生。另外，高危角膜移植(包括受体角膜血管化、持续炎症、再次移植等)数量正呈不断上升的趋势，而即便是局部和全身应用免疫抑制剂，高危角膜移植植片存活率仍低于50％。因此，探明同种异体角膜移植免疫排斥反应的发生机制，寻找更为有效安全的抗排斥方法成为角膜基础研究的焦点。早期的研究已经提出免疫赦免这一概念。Streilein等提出的现代概念是：进入特殊部位的抗原并没有隐匿，而是逸入全身血液循环。但是这些抗原所激发的全身性免疫诱导过程可被该部位的一些局部特征修饰，从而抑制免疫原性炎症的出现。免疫赦免状态的维持与以下眼部特征有关：首先：“被动”特征，如血一眼屏障、缺乏淋巴引流途径、眼部实质细胞很少表达MHCⅠ型或Ⅱ型抗原(减少了T细胞致敏的可能性)；其次：“主动”特征，包括一些眼部细胞特征性表达的分子(如Fas配体和活化的补体成分的膜抑制物)、房水中一系列抑制和调节免疫细胞功能的因子(TGF-β，A2黑色素细胞刺激素、血管活性肠肽、降钙素基因相关多肽、游离皮质醇和IL-1受体拮抗剂等)。这些眼部特征最后通过克隆清除、克隆无反应、免疫偏离、T细胞抑制四种途径诱导对外周抗原特异性T细胞的耐受。其中免疫偏离和T细胞抑制(尤其是免疫偏离)在眼部免疫赦免的形成中起重要作用。Wolvers等人所做的一系列经典实验显示针对鼻粘膜抗原的免疫耐受诱导完全依赖于颈部淋巴结的存在。已经证实作为二级淋巴器官的颈部淋巴结引流包括眼部淋巴在内的头面部淋巴，并与粘膜特异性免疫和耐受有关。高危角膜移植术后同种异体反应性细胞毒性T细胞也在颈部淋巴结产生。近些年国内外的一些动物实验研究显示切除颈部淋巴结可以延长同种异体角膜植片的存活时间。但移植排斥反应过程中颈部淋巴结的免疫及分子生物学方面的作用机制尚未阐明，仍需进一步研究。本实验第一部分是建立同侧和双侧引流颈部淋巴结切除后角膜移植大鼠模型，术后与正常大鼠角膜移植比较植片存活情况，并观察不同处理组各大鼠DTH反应情况，探讨引流颈部淋巴结在大鼠角膜移植中的作用；第二部分建立单纯高危角膜移植模型、同侧及双侧引流颈部淋巴结切除后高危角膜移植模型，与单纯角膜移植相比较，观察各处理组大鼠角膜植片存活情况及DTH反应情况，探讨引流颈部淋巴结在高危角膜移植中的作用。研究目的：1．通过建立大鼠同侧和双侧引流颈部淋巴结切除后角膜移植模型及正常大鼠角膜移植模型，观察角膜HE染色切片，分析同侧和双侧引流颈部淋巴结切除对角膜移植后植片生存情况和DTH反应情况的影响，探讨引流颈部淋巴结在角膜移植中的作用。2．通过建立同侧及双侧引流颈部淋巴结切除后高危角膜移植模型，与正常角膜移植及高危角膜移植比较，观察角膜HE染色切片，分析植片生存情况、DTH反应情况，探讨引流颈部淋巴结切除对高危角膜移植的影响及作用。研究方法：1．以健康清洁级Wistar大鼠为供体，SD大鼠为受体，随机均分为A、B、C3组：A组正常角膜移植组；B组同侧引流颈部淋巴结切除并角膜移植组；C组双侧引流颈部淋巴结切除并角膜移植组(同侧或双侧引流颈部淋巴结切除于角膜移植前2天实施)。角膜移植术后，裂隙灯显微镜下评价植片排斥反应指数(rejection index，RI)，并于术后第14天取角膜植片，制作石蜡切片后行HE染色观察。2．制取灭活脾细胞悬液，注射于各处理组大鼠后肢右足，磷酸盐缓冲液注射后肢左足对照，相同处理作用于已经灭活脾细胞皮下注射致敏的常规免疫大鼠，注射24小时后，测量左足及右足足肿厚度，参照文献运用公式(抗原注射部位足肿厚度—磷酸盐缓冲液注射部位足肿厚度)计算足肿量作为DTH反应检测指标，采用SPSS10.0统计软件进行统计学分析。3．以健康清洁级Wistar大鼠为供体，SD大鼠为受体，随机均分为A、B、C、D4组：A组正常角膜移植组；B组高危角膜移植组(高危角膜参考文献以缝线法诱导)；C组同侧引流颈部淋巴结切除并高危角膜移植组；D组双侧引流颈部淋巴结切除并高危角膜移植组(同侧或双侧引流颈部淋巴结切除于角膜移植前3天实施)。角膜移植术后，裂隙灯显微镜下评价植片排斥反应指数，术后第10天取角膜植片，制作石蜡切片后行HE染色，进行观察。4．参照2中方法检测第二部分中DTH反应，探讨引流颈部淋巴结在高危角膜移植中的作用。研究结果：1．生存时间：(1)第一部分：A、B、C三组移植片平均生存时间分别为：(10.900±0.994)d；(40.800±1.135)d；(41.500±1.080)d。其中，B组、C组与A组相比较差异具有统计学意义(P=0.000；P=0.000)；B组和C组比较差异无统计学意义(P=0.319)。(2)第二部分：A、B、C、D四组移植片平均生存时间分别为：(10.333±0.816)d；(7.166±0.752)d；(15.166±0.752)d；(15.666±1.032)d。其中，C、D组与B组相比较差异具有统计学意义(P=0.000；P=0.000)；C和D组与A组相比较差异具有统计学意义(P=0.000；P=0.000)；C组和D组比较差异无统计学意义(P=0.319)；A组和B组比较差异具有统计学意义(P=0.000)。2．排斥反应指数(RI)：(1)第一部分：移植术后14d，A、B、C三组移植片平均排斥反应指数分别为：7.40±1.57；3.40±0.84；3.00±0.94。其中，B组、C组与A组比较差异具有统计学意义(P=0.000；P=0.000)，B组和C组之间比较差异无统计学意义(P=0.450)。(2)第二部分：角膜移植术后14天，A、B、C、D四组移植片平均排斥反应指数分别为：6.66±1.36；10.16±0.75；6.16±1.16；5.66±1.21。各组之间比较具有显著性(F=18.987，P=0.000)。其中，B组与A组、C组、D组之间比较差异有统计学意义(P=0.000；P=0.000；P=0.000)，C组与A组、D组之间比较差异无统计学意义(P=0.459；P=0.459)，A组与D组之间差异无统计学意义(P=0.147)。3．DTH反应：(1)第一部分：角膜移植术后14天，各组大鼠DTH反应足肿量测量结果之间差异具有统计学意义意义(F=34668.21，P=0.000)；B组、C组与常规免疫组之间差异有统计学意义(P=0.000；P=0.000)，B组、C组与A组之间差异有统计学意义(P=0.008；P=0.001)，A组与常规免疫组之间差异无统计学意义(P=1.000)，B组与C组之间差异无统计学意义(P=0.372)。(2)第二部分：角膜移植术后14天，各组大鼠DTH反应足肿量测量结果之间比较差异有统计学意义(F=9.386，P=0.000)；B组与A组、C组、D组、及常规免疫组之间比较差异有统计学意义(P=0.006；P=0.000：P=0.000；P=0.012)，B组与A组、D组、及常规免疫组之间差异无统计学意义(P=0.227；P=0.513；P=0.127)，A组与D组、常规免疫组之间差异无统计学意义(P=0.082；P=0.743)，D组与常规免疫组之间差异有统计学意义(P=0.043)。4．HE染色组织切片观察：(1)第一部分：A组植片组织水肿，基质层明显增厚，胶原纤维排列紊乱，有较多的新生血管形成及大量的炎性细胞浸润；B组、C组植片组织水肿增厚，大量炎性细胞浸润，两组之间无明显差异。(2)第二部分：A组及B组植片组织水肿，基质层明显增厚，胶原纤维排列紊乱，有较多的新生血管形成及大量的炎性细胞浸润，B组较A组情况重；C组、D组植片大量炎性细胞浸润，新生血管较A组、B组明显减少。结论：1．引流颈部淋巴结切除对大鼠角膜移植免疫排斥反应具有显著的抑制作用。2．同侧引流颈部淋巴结切除与双侧引流颈部淋巴结切除对抑制排斥反应的作用效果基本相同；衡量两侧引流颈部淋巴结，同侧引流颈部淋巴结在移植免疫中起主要作用。3．切除引流颈部淋巴结可能通过抑制同种异体致敏过程，从而阻止同种异体特异性DTH反应的诱导和(或)产生，最终起到保护植片的作用；同侧颈部淋巴结切除和双侧淋巴结切除对植片存活的影响无明显不同，颈部淋巴结在角膜移植中的作用主要集中在同测颈部淋巴结。4．引流颈部淋巴结切除对高危角膜移植排斥具有明显的抑制作用，可以延长植片生存时间。