论文部分内容阅读
背景铜绿假单胞菌是一种常见的条件致病菌,是医院内感染的主要病原菌之一,其引起的很多感染发生在病情严重或免疫受损的住院病人中,在重症监护室感染的常见的病原菌中位列第二,也是呼吸机相关性肺炎的常见病因。同时也经常引起术后伤口感染、褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等。近年来,其耐药性日益严重。产生耐药的重要原因之一是生物膜的产生。C4-HSL是铜绿假单胞菌群体感应系统中rhl系统的自身诱导信号分子,在体外生物膜培养模型下,C4-HSL信号分子浓度远超其它群体感应系统的信号分子,是铜绿假单胞菌体外生物膜形成的关键因子之一。本课题组前期已成功构建针对小分子C4-HSL高特异性和强亲和力的适配体,能够在体外减少生物膜的生成量。然而,适配体对铜绿假单胞菌的作用能力还不明确,有待于进一步的研究。目的探讨适配体对铜绿假单胞菌一系列毒力因子(弹性蛋白酶、蛋白水解酶、绿脓菌素)的影响,并进一步探索适配体与C4-HSL结合后使铜绿假单胞菌毒力发生变化的机制。方法1、限定合适的条件筛选菌株:条件为呼吸内科送检的肺泡灌洗液标本,半年内送检/培养至少两次,且培养结果为铜绿假单胞菌,但未严格区分耐药菌或非耐药菌;2、用针对C4-HSL的适配体(为A1、A2、A16、A46的混合物)干预铜绿假单胞菌的生长过程,来检测对毒力因子弹性蛋白酶、蛋白水解酶和绿脓菌素的影响;3、通过苔黑酚法测定鼠李糖脂的变化情况及通过RT-qPCR(实时荧光定量多聚酶链式反应)技术检测合成鼠李糖脂中关键基因thlA、thlC、thlR、thlI的表达量的变化。结果1、成功分离纯化4株铜绿假单胞菌;2、蛋白水解酶检测结果显示,适配体实验组铜绿假单胞菌蛋白水解酶的吸光值为(0.474±0.65),较对照组(0.604±0.320)降低(t=4.561,P=0.0198);弹性蛋白酶检测结果显示,适配体实验组铜绿假单胞菌弹性蛋白酶的吸光值为(1.877±0.694),较对照组(2.126±0.777)降低(t=3.414,P=0.042);绿脓菌素检测结果显示,适配体实验组铜绿假单胞菌绿脓菌素的吸光值为(0.196±0.286),较对照组(0.468±0.690)降低,但无统计学差异(t=1.343,P=0.272);3、鼠李糖脂检测的吸光值为9.377±4.387,结合C4-HSL的适配体后,上清液中鼠李糖脂的含量降低,为6.745±4.649(t=4.865,P=0.01 66),具有统计学意义。RT-qPCR(实时荧光定量多聚酶链式反应)检测合成鼠李糖脂中关键基因rhlA、thlC、thlR、thlI的表达量的变化情况为:thlA在与适配体共培养的四株细菌中表达下降,相对表达量为0.361±0.259,与对照组相比(设对照组为“1”),具有统计学意义(t=4.925,P=0.016)。thlC、thlR、rhlI在四株细菌中变化情况不一致,无法作统计学分析。结论1、针对小分子C4-HSL的适配体可以抑制铜绿假单胞菌胞外毒力因子:蛋白水解酶、弹性蛋白酶和绿脓菌素。2、针对小分子C4-HSL的适配体抑制铜绿假单胞菌胞外毒力因子可能通过下调基因thlA,降低鼠李糖脂的表达从而抑制生物膜的产生。