研究背景:绝经期会发生包括骨代谢、糖脂代谢等在内的诸多代谢紊乱。研究表明绝经状态与高血糖密切相关,并且这种相关性是独立于年龄和多种代谢因子(比如BMI和血甘油三酯水平)的。由卵巢功能衰竭导致的雌激素水平降低可以部分解释血糖升高,但是也有文献报道雌激素可以升高血糖,该矛盾表明绝经期还存在另外升高血糖的机制。除了雌激素降低,绝经期另一大特征是卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone,FSH)水平明显升高。一项关于原发性卵巢功能衰竭的临床研究表明FSH与空腹血糖呈正相关。然而其中的具体机制未明。卵泡刺激素是一个由垂体分泌的促性腺激素,特异性作用于性腺的卵泡刺激素受体(FSHR),该受体是 G 蛋白偶联受体(G-protein-coupledreceptor,GPCR)。近来越来越多的研究表明FSHR存在于性腺外组织器官,如脂肪组织、胆管上皮、肝脏、骨骼等。为了探索FSH调节空腹血糖的具体机制,我们关注了 GRK2(GPCRkinase 2)。近来有证据表明GRK2主要通过与非GPCR分子直接相互作用,在胰岛素通路中发挥重要作用。而在肝脏糖代谢调节中,这与传统认为的GRK2引起GPCR脱敏的效应是相反的。在FSH通路中,GRK2的哪个功能占据主导地位尚不清楚。糖异生是人类维持血糖水平的主要机制,而肝脏是糖异生的最主要器官。在2型糖尿病患者中,过度的肝脏糖异生是导致高血糖的主要因素。PEPCK(Phosphoenolpyruvate carboxykinase)和 G6Pase(Glucose-6-phosphatase)是糖异生过程中的关键酶,它们的转录水平决定糖异生的多少。转录共激活因子CRTC2(Cyclic AMP-regulated transcriptional coactivator 2)被激活后入核可以刺激这两个酶的转录。AMPK(AMP-activated protein kinase)是细胞内重要的能量感受器,它可以使CRTC2失活并阻断其入核。有研究表明,AMPK的活性可以被磷酸化调节,如Ser485磷酸化为失活,Thr172磷酸化为激活。在本研究中,我们探索了 FSH是否能调节肝脏糖异生,以及AMPK和CRTC2是否参与其中。在本论文中,我们探究了 FSH对肝脏糖异生的促进作用。我们论证了 FSH经FSHR作用于GRK2,通过AMPK的Ser485位点磷酸化抑制其Thr172位点磷酸化,引起AMPK失活,进而促进了 CRTC2介导的糖异生关键酶PEPCK及G6Pase转录。分别通过体内研究(双侧卵巢去势、补充雌激素并注射不同剂量FSH小鼠,Fshr基因敲除小鼠,注射Fshr干扰病毒小鼠,Crtc2基因敲除小鼠,注射GRK2特异性抑制剂小鼠)与体外细胞水平研究(多种肝细胞株及肝原代细胞),论证了 GRK2/AMPK/CRTC2通路在FSH调控肝脏糖异生中的地位和作用,阐明了 FSH对肝脏糖异生的影响及分子机制。为探究绝经期高血糖的分子机制提供新的观点;在医学实践上为治疗空腹高血糖提供新的思路和策略。目的:1、明确在双侧卵巢去势、补充雌激素并注射不同剂量FSH的小鼠模型中,FSH可以增强肝脏糖异生,且糖异生过程中的关键酶表达增加。2、通过注射GRK2特异性抑制剂的小鼠模型,体外过表达及干扰GRK2的细胞模型,探究FSH对GRK2的影响及GRK2的作用方式。3、通过体内外实验证实FSH对糖异生的上调作用依赖于AMPK Ser485位点过度磷酸化。4、在Fshr基因敲除小鼠及注射Fshr干扰病毒小鼠、Crtc2基因敲除小鼠中分别探究FSHR与CRTC2在其中发挥的作用。研究方法:1、动物模型(1)OVX+E2小鼠模型:8周龄雌鼠被随机分为4组:1)假手术(Sham),2)双侧卵巢去势并补充雌激素(OVX+E2),3)OVX+E2并补充低剂量FSH(OVX+E2+L-FSH),4)OVX+E2 并补充高剂量 FSH(OVX+E2+H-FSH)。(2)OVX+E2小鼠被随机分为4组:对照(生理盐水),高剂量FSH,GRK2抑制剂,GRK2抑制剂 +高剂量FSH。(3)Fshr基因敲除小鼠:雌性Fshr-/-小鼠从3周龄起开始补充雌激素,同窝出生的雌性野生型小鼠作为对照。8-10周龄时所有小鼠行双侧卵巢去势手术(这之后野生型小鼠也补充雌激素),然后再每日注射高剂量FSH持续两周。(4)Crtc2基因敲除小鼠:雌性Crtc2-/-和其同窝出生的雌性野生型小鼠均行双侧卵巢去势、补充雌激素并每日注射高剂量FSH或溶媒两周。(5)Fshr干扰RNA:OVX+E2小鼠被注射Fshr干扰腺病毒7天后(需重复注射),每日注射FSH或溶媒持续两周。2、糖代谢相关:小鼠进行口服糖耐量试验(OGTT)、胰岛素耐量试验(ITT)、丙酮酸耐量试验(PTT),观察FSH对小鼠整体糖代谢水平的影响。3、小鼠空腹8小时或者禁食后再进食(Refed)之后被处死,即刻收集血和组织。血液用于血糖、FSH及E2的测定;组织用于各项指标的检测等。4、苏木精—伊红染色及糖原染色:石蜡包埋的肝脏组织切片用于苏木精—伊红(H&E)染色及糖原(PAS)染色,观察肝细胞的组织学特征及肝细胞内糖原颗粒的分布情况。5、免疫荧光:用于检测肝脏中GRK2的表达和分布情况。6、细胞培养:HepG2细胞、小鼠肝细胞(NCTC 1469 cells)及小鼠肝原代细胞根据相应的培养条件培养。以FSH(处理浓度为0,10,50和100 ng/ml)处理6或24小时,以胰岛素(处理浓度为100nmol/1)处理4或6小时。以胰高血糖素(浓度为100 nmol/1)、PKA特异性抑制剂PKI(浓度为10 μmol/1)、AMPK特异性激动剂AICAR(浓度为1 mmol/1)等其他试剂处理时,于FSH前2小时加入。7、Grk2短发夹RNA:将Grk2shRNA转入NCTC 1469细胞,以干扰GRK2表达。8、AMPK干扰 RNA:将 AMPK 各亚基的 siRNA(针对人AMPKal,AMPKa～2,AMPKβ1和AMPKγ1)转入HepG2细胞,以分别干扰其表达。9、糖产出实验:HepG2细胞被加相应处理后,用糖测定试剂盒测定上清培养基中的葡萄糖浓度,并以细胞蛋白浓度作校正。10、质粒构建、转染及双荧光素酶活性检测:采用过表达GRK2质粒、过表达含有绿色荧光蛋白标签(GFP)的野生型AMPK及485位点突变为丙氨酸的AMPK质粒、含有野生型PEPCK及G6Pase启动子的荧光素酶报告基因质粒及含有CRE位点突变的PEPCK启动子荧光素酶报告基因质粒,共转海肾荧光素酶报告基因质粒作为对照。11、RNA提取及实时荧光定量RT-PCR检测各因子基因水平的表达:小鼠Pepck(Pckl),G6pase(G6pc),Crtc2,Pgcla(Ppargcla),Gck,Pfkfb1,Pygl,Gys2 和 β-actin(Actb):人 PEPCK,G6Pase,GLUT2(SLC2A2),GLUT4(SLC2A4),AMPK(PRKAA1)和 β-actin(ACTB)。12、蛋白提取及western blotting检测各蛋白表达水平:p-Thr172 AMPKa,p-Ser485 AMPKa,AMPKa,AMPKβ1,p-Ser428 liver kinase B1(LKB1),p-Ser9 glycogen synthase kinase 3β(GSK3β),GSK3β,p-Ser307 IRS1,p-Ser133 cyclic AMP response element-binding protein(CREB),CREB,p-Ser473 Akt,Akt,GLUT2,GLUT4,LKB1,CRTC2,GRK2,AMPKy1,FSHR,G6Pase,p-Ser670 GRK2,PEPCK,PGC1a,GFP,LMB1和 GAPDH。13、免疫共沉淀(Co-IP)检测GRK2与AMPK的结合。14、统计学分析:采用SPSS17.0统计软件分析实验数据。定量数据用均数±标准误(x ± SEM)表示,组间均数的比较采用t检验和单因素方差分析,P<0.05被认为有统计学差异。结果:1、FSH在卵巢去势小鼠中上调肝脏糖异生FSH以剂量依赖的方式升高空腹血糖(P<0.05)。OGTT结果表明FSH影响全身的糖代谢,同时它并不明显影响血清胰岛素水平(P>0.05)。在注射FSH后,骨骼肌中的磷酸化IRS1(Ser307)、磷酸化Akt(Ser473)和GLUT4水平没有明显变化,ITT结果也没有明显变化,说明FSH对胰岛素敏感性没有明显调节作用。PTT结果表明FSH可以增强小鼠肝脏糖异生(P<0.05),而且是剂量依赖的。即使是在禁食又再次给食的情况下,FSH也升高血糖水平。同样的,在体外FSH也可以提高糖产出(P<0.05)。2、FSH增强肝脏中糖异生关键酶的表达糖原染色表明,FSH并不影响肝脏糖原含量。并且FSH不影响GLUT2和GLUT4的mRNA和蛋白水平,在一定程度上表明糖摄取未被明显调节。在空腹小鼠中,糖异生的关键酶PEPCK和G6Pase的mRNA和蛋白水平被FSH明显上调(P<0.05),并且mRNA水平在禁食又给食小鼠中也有相同发现。而肾脏两个酶水平并无明显变化。在HepG2细胞中,FSH对PEPCK和G6Pase的上调是时间依赖的。另外,FSH也可以在体外增强PEPCK和G6Pase启动子的荧光素酶活性(P<0.05)。3、CRTC2被FSH激活并参与了其对肝脏糖异生的调节注射FSH之后,Crtc2和Pgc1a(调节肝脏糖异生的另一个转录共激活因子)的mRNA水平无明显变化。值得注意的是,FSH显著提高小鼠肝脏细胞质和细胞核中非磷酸化CRTC2(活性形式)蛋白水平,且成剂量依赖性。相应的,在HepG2细胞中也有相同发现。即使在禁食再给食或胰高血糖素处理的情况下,FSH依然可以增强CRTC2活性。Crtc2-/-小鼠与同窝对照Crtc2+/+小鼠相比,PTT结果下降。而且在Crtc2-/-小鼠中,注射高剂量FSH并未明显影响PTT结果。Pepck和G6pa 的 mRNA 变化水平与 PTT 结果一致(P<0.05)。当 CRTC2-CREB复合物在PEPCK基因启动子上的结合位点CRE被突变后,FSH的作用被显著减弱。FSH并不调节CREB的磷酸化水平,但是用PKI抑制CREB的活性可以部分阻断FSH对PEPCK和G6Pase的调节。4、AMPK对于FSH调节肝脏糖异生是必不可少的注射FSH后,小鼠肝脏AMPK Ser485位点的磷酸化水平呈剂量依赖性升高,然而Thr172位点的磷酸化水平则相反。体外HepG2细胞的结果与体内类似。AMPK特异性激动剂AICAR可阻断FSH对PEPCK和G6Pase的调节。并且过表达突变质粒AMPK S485A完全阻断了 FSH对AMPK Ser485、Thr172位点的磷酸化水平以及对PEPCK和G6Pase蛋白水平的调节。5、FSH通过GRK2调节AMPK依赖的肝脏糖异生FSH以剂量依赖性的方式增加GRK2蛋白水平,并促进其向细胞膜的转运,提示FSH可以激活GRK2。FSH提高Pepck和G6pasemRNA水平的作用被GRK2特异性抑制剂阻断(P<0.05),并且,GRK2抑制剂也阻断了 FSH对磷酸化AMPK和CRTC2的影响。在体外,抑制GRK2可以减少AMPK的Ser485位点磷酸化,增加其Thr172位点磷酸化。过表达GRK2则得到相反的结果。然而过表达AMPK S485A可以阻断过表达GRK2所带来的效应。值得注意的是,免疫共沉淀实验表明GRK2可以与AMPK结合,而且FSH可以增强这种结合,GRK2抑制剂则使其减弱。分别干扰AMPK各亚基后我们发现是AMPKα1和α2,而并非β1或γ1,在结合中发挥作用。6、敲除Fshr基因阻断了 FSH的作用与同窝对照Fshr+/+小鼠相比,Fshr-/-小鼠空腹血糖和PTT结果均明显降低(P<0.05)。肝脏PEPCK和G6Pase的mRNA及蛋白水平也有相同变化趋势(P<0.05)。在Fsh-/-小鼠肝脏中,GRK2、磷酸化AMPK(Ser485位点)、CRTC2蛋白水平均明显下降而AMPKThr172位点磷酸化上升。给小鼠尾静脉注射Fshr siRNA也同样阻断了 FSH对Pepck和G6pase的调节。结论:1、在肝脏中,FSH通过GRK2增强了糖异生,这个过程依赖于AMPKSer485位点的磷酸化。2、GRK2与AMPK的α亚基结合并诱导后者Ser485位点磷酸化,导致了 AMPK的失活。3、敲除Crtc2或Fshr阻断了 FSH的作用,表明CRTC2及FSHR在FSH调节糖异生中发挥重要作用。