论文部分内容阅读
第一部分端粒结合蛋白CTC1的表达与人乳腺癌细胞放射敏感性的关系研究目的：构建人放射敏感/放射抗拒乳腺癌细胞模型,研究端粒结合蛋白CTC1的表达与人乳腺癌细胞放射敏感性的相关性。方法：1.以人乳腺癌细胞株MDA-MB-435为研究对象,采用X射线分次外照射模式,给予每周一次600cGy剂量照射,共12次,再经传代培养30代以上使得细胞性状稳定后,获得具有放射抗拒性状的辐射诱导子代细胞MDA-MB-435R.常规克隆形成实验测定两株细胞经不同剂量X射线照射后的细胞存活分数,拟合细胞存活曲线,通过比较两种细胞株的放射生物学参数鉴定其放射敏感性。2.利用针对CTC1的siRNA干扰上述细胞模型48h, realtime PCR鉴定其干扰效果并确定最佳干扰序列。利用最佳干扰序列构建shC TCI质粒,通过G418筛选shCTCl稳定转染人乳腺癌细胞株。采用RealtimePCR和western blot分别检测两种细胞经最佳干扰序列干扰前后细胞中CTC1的mRNA及蛋白水平的变化。3.利用克隆形成实验测定两株细胞经最佳干扰序列干扰前后放射生物学参数的变化。结果：1. MDA-MB-435细胞株经分次外照射诱导后获得的子代细胞生长稳定、状态良好,并获得了显著而稳定的放射抗拒性,将其命名为MDA-MB-435R.克隆形成实验结果显示：MDA-MB-435R细胞株较MDA-MB-435细胞株具有明显的放射抗性,其DO值分别为(3.266±0.072)vs.(2.093±±0.131)(P<0.01)；Dq值分别为(2.379±0.108)vs.(2.088±0.046)(P>0.05)；SF2值分别为(0.701±0.016)vs.(0.574±0.018)(P<0.01)。说明构建放射抗拒的人乳腺癌细胞株获得成功。2.三条干扰序列均能降低两种细胞中CTCl mRNA的水平,其中,siCTCl#3为最佳干扰序列。shNC和shC TCl和分别在G418筛选和维持培养后第16、19天开始出现阳性克隆。然而,从第31～33天开始,不同批次G418筛选的shCTCl稳定转染细胞株相继出现死亡,而对照组shNC稳定转染细胞株存活。经siCTCl#3处理细胞后,两种细胞中CTC1的mRNA及蛋白水平较对照组显著降低(P<0.05)：在MDA-MB-435细胞株中,siCTCl#3组CTC1的mRNA及蛋白水平分别是转染试剂Mock组的(23.42±±8.05)%和(46.29±±9.56)%；在MDA-MB-435R细胞株中,siCTCl#3组CTC1的mRNA及蛋白水平分别是转染试剂Mock组的(18.25±±6.74)%和(72.044±4.26)%。MDA-MB-435R细胞株中CTC1的mRNA水平和蛋白水平分别是MDA-MB-435细胞株的1.6±0.15倍和1.36士0.18倍(P<0.05)。3.在两种细胞中,siCTCl#3组的SF2值分别明显低于两个对照组siNC和Mock组(P<0.05)；而siNC和Mock组的SF2值差异无统计学意义(P>0.05)。结论：成功构建了人放射敏感／放射抗拒乳腺癌细胞模型——MDA-MB-435/MDA-MB-435R细胞,MDA-MB-435R细胞株较MDA-MB-435细胞株具有明显的放射抗性。端粒结合蛋白CTC1的表达水平与人乳腺癌细胞的放射敏感性呈负相关。未成功构建shCTCl#3稳定转染人乳腺癌细胞株；而对照组shNC稳定转染人乳腺癌细胞株构建成功并存活。第二部分端粒结合蛋白CTC1增强人乳腺癌细胞放射抗性的机制初探目的：探讨端粒结合蛋白CTC1提高人乳腺癌细胞放射抗性的潜在作用机制,为乳腺癌的防治提供一个新的有效靶标,从而为临床采取更为有效的个体化治疗方案提供重要的理论依据。方法：将siRNA (siCTC1#3和siNC)利用脂质体转染至MDA-MB-435/MDA-MB-435R细胞48h后：1.CCK8试剂盒检测细胞增殖及细胞毒性；2.台盼蓝染色测定细胞增殖动力学；3. Realtime PCR检测细胞相对端粒长度；4.免疫荧光检测细胞的DNA损伤修复能力及CTC1蛋白与yH2AX的共定位情况；5.流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况；6.检测细胞Caspase-3的活性以明确细胞早期凋亡事件的触发情况。结果：1.siCTC1#3组的450nm吸光度值显著低于两个对照组(siNC组和Mock组),增殖能力明显减弱(P<0.05)。2.MDA-MB-435细胞与MDA-MB-435R细胞的群体倍增时间分别为30h和44.5h,放射抗拒细胞较亲代细胞延长了14.5h,其对数生长期的增殖速度明显减慢(P<0.01)。3.MDA-MB-435R细胞的相对端粒长度为MDA-MB-435细胞的2.06±0.23倍(P<0.01)；两种细胞中,Mock组与siNC组相对端粒长度无统计学差异(P>0.05),而siCTC1#3组的相对端粒长度显著低于两个对照组(P<0.05)。4.放射抗拒株MDA-MB-435R细胞中γH2AX焦点的数量明显少于放射敏感株MDA-MB-435细胞(P<0.05)。此外,在MDA-MB-435细胞株中,γH2AX阳性细胞的百分比在单纯照射组和射线联合干扰组中分别为(73.14+4.74)%和(92.35±3.22)%(P<0.05)；平均每个细胞中γH2AX的数量分别为(2.7±0.5)个和(5.8±0.3)个(P<0.01)。在MDA-MB-435R细胞株中,γH2AX阳性细胞的百分比在单纯照射组和射线联合干扰组中分别为(25.36±3.92)%和(56.72±5.34)%(P<0.01)；平均每个细胞中γH2AX的数量分别为(1.3±0.2)个和(2.8±0.3)个(P<0.01)。γH2AX焦点与CTCl蛋白并无明显的共定位现象。5.在MDA-MB-435细胞中, siCTC1#3、siNC和Mock组的G2/M期细胞比率依次为(18.02±1.93)%、(16.24±2.45)%和(14.97+2.58)%；在MDA-MB-435R细胞中,siCTC1#3、siNC和Mock组的G2/M期细胞比率依次为(16.37±2.14)%、(15.44±1.85)%和(14.31±2.96)%。与两个对照组(Mock组与siNC组)相比,siCTC1#3组并没有明显引起细胞周期时相的改变(P>0.05)。在MDA-MB-435细胞株中,单纯照射组和射线联合干扰组的细胞凋亡率分别为(26.84±3.91)%和(49.32±5.67)%(P<0.01),且两组细胞的细胞坏死率分别为(9.05±2.32)%和(19.15±4.26)%(P<0.01)；在MDA-MB-435R细胞株中,单纯照射组和射线联合干扰组的细胞凋亡率分别为(21.26±6.75)%和(46.21±4.24)%(P<0.01),而两组细胞的细胞坏死率分别为(4.68±2.05)%和(5.14±2.17)%(P>0.05)。6.两株细胞中Caspase-3的活性在转染后12h开始升高,24h达高峰,48h后逐渐下降,至96h后活性极低。在转染后24h, MDA-MB-435和MDA-MB-435R细胞中siCTCl#3组Caspase-3的活性分别为相应Mock组的4.36±0.53倍和3.21±0.24倍(P<0.01)。结论：端粒结合蛋白CTC1提高人乳腺癌细胞放射抗性的机制与该蛋白促进肿瘤细胞增殖、促进DNA损伤修复、抑制端粒缩短和抗细胞凋亡有关,而与调节细胞周期进程无关。第三部分端粒结合蛋白CTC1在人乳腺癌组织中的表达与临床病理特征分析目的：比较乳腺浸润性导管癌患者肿瘤组织与癌旁组织中端粒结合蛋白CTC1的表达差异,并分析CTC1蛋白的表达水平与病理分级和淋巴结转移情况等相关临床病理特征的关系,为乳腺癌的治疗寻找新的治疗靶点。方法：收集武汉大学中南医院病理科存档的57例乳腺癌患者组织标本切片。入组标准：我院肿瘤科2007.6～2008.12收治的首诊乳腺癌患者；未行术前新辅助化疗；所有患者均经过影像学检查及手术后病理确诊为浸润性导管癌；无其他原发肿瘤。随访时间截止于2013年12月31日。利用免疫组化法检测患者肿瘤组织与癌旁组织中端粒结合蛋白CTC1的表达差异,分析CTC1蛋白在不同的年龄、绝经情况、肿瘤大小、病理分级、激素受体状态、淋巴结转移情况、5年局部复发情况和5年生存状态的乳腺癌患者中的表达情况。Kaplan-Meier方法分析CTC1蛋白的表达对乳腺癌患者5年局部累积复发率和5年生存率的影响。结果：在57例乳腺癌患者的肿瘤组织中,CTC1蛋白阳性表达者为38例,阳性表达率为66.67%；而在22例乳腺癌患者的癌旁组织中,CTC1蛋白阳性表达者为3例,阳性表达率为13.64%,两者的差异有显著统计学意义(P<0.01)。CTC1蛋白的阳性表达率在不同年龄、不同绝经情况、不同肿瘤大小、不同激素受体状态、不同5年局部复发情况和不同5年生存状态的乳腺癌患者中无显著统计学差异(P>0.05)；而病理分级高的乳腺癌患者的CTC1蛋白的阳性表达率明显高于病理分级低(P=0.023)的患者；不同淋巴结转移情况的乳腺癌患者的CTC1蛋白的阳性表达率有显著性差异(P=0.003)。CTC1蛋白高表达组和低表达组乳腺癌患者的5年局部累积复发率分别为6.46%和0%,但两组之间差异无统计学意义(P=0.279,95%CI=0.116-3.621).CTCl蛋白高表达组的5年生存率低于CTC1蛋白低表达组,但二者差异无统计学意义(p=0.194,95%CI=0.236~1.340). CTCl蛋白高表达组和低表达组的平均中位生存时间分别为50个月和58个月。结论：端粒结合蛋白CTC1在人乳腺癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织,且它与乳腺癌的病理分级和淋巴结转移情况密切相关,而可能与乳腺癌患者的5年局部累积复发率和5年生存率无关。