[背景和目的]恐惧是物种进化与生存过程中最重要和最不可或缺的基本情绪表征之一,来自外界的危险刺激可以激发生物体的防御行为,使得人和动物面对危险做出回避反应以保护机体不受伤害,因此恐惧在生物体的生存和繁衍有非常重要作用。然而惊慌失措,惶惶不安,这样的恐惧情绪却并非人所必须。巴甫洛夫条件性恐惧反射是研究恐惧记忆的获得、存储、提取以及消退等过程的经典行为范式以及相应的中枢机制。条件性恐惧反射基本原理是利用中性刺激(如声音)与厌恶性非条件性刺激(unconditioned stimulus,US)(如足底电击)进行联结匹配训练多次后,当这个中性刺激单独出现时,也可以引起恐惧反应称为条件性反应(conditioned response,CR,例如僵呆行为),这个中性刺激成为条件性刺激(conditioned stimulus,CS),若条件性刺激反复单独呈现,而不匹配厌恶刺激时,动物先前习得的对CS的条件性恐惧反应会逐渐熄灭,这即是条件性恐惧记忆的消退。这是暴露疗法的理论基础。对于进行过恐惧条件化训练的动物,CR呈现明显减少,随着间隔时间的延长CR会增加,一段时间不进行恐惧消退训练,CR表达显著增加,消退后的条件反应经过一段时间又可恢复,说明先前形成的条件性恐惧记忆并没消失。这种恐惧记忆的消退并不是消除或忘记了已建立的CS-US联系,而是形成了一种新的学习记忆过程CS-no US。条件恐惧记忆的消退过程可能是新建立的记忆过程CS-no US记忆逐渐增强、抑制以前的CS-US恐惧记忆的过程,两种记忆同时存在互相竞争控制恐惧反应。这种情况说明恐惧消退不是简单的对原来的恐惧记忆的遗忘,而是重新获得了一种“安全”的记忆,暂时抑制或者掩盖了原来的恐惧记忆;恐惧记忆一旦获得后就难以熄灭,容易复发,而这一点在创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder,PTSD)患者中表现尤为明显。所谓PTSD是指经历重大的威胁性或灾难性事件后导致精神受到严重伤害而产生的心理创伤,患者长期被持续的精神障碍所困扰。具体的表现为:创伤经历反复重现、逃避创伤事件和警觉性增高三大主要症状。这种障碍对患者来讲是一种非常恐怖的事件,这种创伤性记忆会日复一日在脑海中重现,严重影响正常的生活和工作,其本质是与创伤事件相关的条件性恐惧记忆的再现。如从战场归来的PTSD 士兵可能会把直升飞机的轰鸣与某次严重创伤经历联系起来,一听到直升飞机的声音就会引起其强烈的恐惧反应。目前征对创伤后应激障碍主要采取暴露疗法,暴露指的是再次面对经历创伤的回忆等,由于病人面对他们的恐惧刺激时并没有紧跟着的厌恶刺激,患者能够习惯恐惧、从而逐步消除恐惧的反应,不幸的是,由于原来的恐惧记忆保持完好,遇到CS时的恐惧是可以恢复的。已经消退的恐惧记忆会重现极大的限制了暴露疗法的功效。由于恐惧消退记忆的获取、巩固和提取涉及的脑区与恐惧记忆的脑区相同,但可能涉及的神经环路有所不同。条件性恐惧反应的神经生物学基础被认为是恐惧消退难以的重要原因,因此,许多研究将PTSD治愈的希望寄托在揭示恐惧条件性记忆消退的神经环路机制。行为学的研究己经证明,恐惧的消退主要涉及到三个区域:杏仁体基底外侧核(the basolateral amygdala,BLA),内侧前额叶皮层[the medial prefrontal cortex,MPF,MPF由内侧前额叶边缘前区(prelimbic region,PL),内侧前额叶边缘下区(infralimbic region,ILA),前扣带回皮层区(anterior cingulate,ACA)三部分组成]和海马(the hippocampus,HPF)。杏仁体附着在海马的末端,呈杏仁状,是边缘系统的一部分。在情绪表达中起着重要的作用,恐惧的表达与杏仁体的作用密切相关。其位于颞叶前部、侧脑室下角尖端上方,海马旁回钩的深面,与尾状核的末端相连。BLA是杏仁体内部主要的感觉信息接口,它接收和整合来自于不同部位的感觉信息,包括来自于膝状体,初级听皮层,嗅皮层,岛叶皮层和海马体(包括CA1区,梨状皮层,下脚和内嗅皮层)的信息输入。所有的这些信息在BLA处进行信息整合后被传递至恐惧应答的区域杏仁体中央核(central amygdale,CEA),然后投射至脑干和下丘脑的不同区域,从而产生不同的反应,例如投射到中脑导水管周围灰质(periaqueductal gray,PAG)产生僵呆反应,投射到脑桥网状核产生惊跳反射,投射至外侧下丘脑、迷走神经背侧核产生心跳加快,血压升高等心血管反应,投射至臂旁核产生呼吸变缓等呼吸系统反应,投射至下丘脑室旁核和终纹床核产生激素水平升高等应激反应。BLA不仅参与恐惧表达,而且也是恐惧消退中的重要一环。越来越多的行为学证据表明BLA参与了恐惧消退记忆的获取,巩固和重现。一系列的研究显示,前额叶皮层的内侧区MPF在恐惧与恐惧消退中起了不同的作用,目前所知的是ILA参与了恐惧消除记忆的巩固与重现,这是是通过对CEA输出的抑制来实现的。而PL主要参与了恐惧记忆表达和背景相关的记忆。推测MPF在恐惧记忆中的表达和巩固是通过去抑制杏仁体内的抑制性中间神经元,进而兴奋CEA功能的。那么到底是来自哪里的神经输入导致MPF的神经反应导致恐惧的表达或者消退呢?一系列的研究显示,这个区域最有可能就是HPF。MPF接受来自HPF兴奋性投射,HPF是参与背景记忆相关调节的最重要的脑区,它参与了背景记忆的编码和背景依赖的消退记忆的提取。这些区域及其亚区分支之间的相互连接,以及这些区域与其他脑区之间的连接如何对行为进行调节目前还不是十分清楚。为了进一步认识恐惧消退行为,需要建立一个明确定义的神经连接基础。因此,建立恐惧消退的神经网络连接基础,将有利于指导我们推断相关这些结构以及结构不同亚区之间对于恐惧消退行为所起的不同作用。[方法]为了了解特定大脑区域所有传入,传出和传入与传出之间的相互连接,确定不同的脑区如何建立连接以协同工作从而产生不同行为,同时连接不同脑区的中间区域在其中也是非常重要的。在同一只老鼠的指定脑区共注射逆行与顺行的追踪剂可以同时显示所有这些信息。我们使用了一种独特的逆行顺行追踪剂同时注射的方式,分别使用的是一种菜豆白细胞凝集素(顺行)与霍乱毒素B亚基(逆行)(PHAL/CTB)和结合生物素的葡聚糖胺(顺行)与荧光金(逆行)(BDA/FG)进行顺行与逆行追踪。双共注射方法是指在同样一只的动物的同样的解剖学区域同时注射一个顺行(PHAL或BDA)和一个逆行示踪剂(CTB或FG)的混合物。顺行示踪剂如PHAL(绿色)和BDA(红色)由注射部位胞体传出并传送到终端终扣从而显露注射部位的传出神经,而CTB(品红色)和FG(金色)逆行示踪剂是显示的是终端终扣传送到注射部位的胞体。PHAL和CTB的重叠或BDA和FG的重叠表示两个注射部位之间的注射部位和目标区域之间的相互连接。不同部位分别注射PHAL和FG或BDA和CTB的重叠部分它们之间互相连接的中间区域。通过对MPF,杏仁体,HPF和尾壳核(caudoputamen,CP)同时注射顺行和逆行的示踪剂,并对得到的数据进行分析。通过同时注射顺行示踪剂与逆行示踪剂的方法得到了恐惧消退通路的解剖连接,但是这些连接是否有突触的传递,具备功能性的连接是不清楚的。采用光遗传学的手段,我们可以以更精准的方式进行神经环路进行研究。记录光诱发的反应能对这些功能性回路进行确认。[结果]1.mBLAa同额叶中与恐惧消退相关脑区之间的连接结果表明BLA的前部(the anterior BLA,BALa)而不是杏仁体的其他部分与ILA和PL选择性地发起双向连接。在PL同时共注射顺行示踪剂和逆行示踪剂(BDA/FG),BDA顺行标记的纤维和FG逆行标记的细胞中在BLAa的内侧部分(the medial division of anterior BLA,mBLAa)重叠,显示出很强的相互mBLAa(?)PL连接。与此相反的是,在ILA共注射(PHAL/CTB)揭示了 ILA突出到 mBLAa,但主要从外侧 BLAa(the lateral division of anterior BLA,lBLAa)接收输入lBLAa→ILA→mBLAa;非常有意思的一点在于,在PL与ILA进行逆行示踪标记的神经元只在BLAa,这些连接通路只存在BLAa而没有在其他杏仁体的其他部分,这些充分说明了 MPF-BLA恐惧消除通路中BLAa的重要性。通过光遗传手段同时证明这些区域存在着功能性的连接。mBLAa同时投射到前扣带回皮层的背侧(dorsal ACA,ACAd)和腹侧(ventral AVA,ACAv),并接收这些皮层少量的输入。ACA是情感学习的重要组成部分,同样是处理创伤性刺激,形成恐惧记忆的重要部位。位于MPF下方的眶额叶皮层(orbitofrontalcortex,ORB)也是情绪处理的部位之一,在恐惧记忆的消退过程中起到非常重要的作用。mBLAa同时连接到ORB。2.mBLAa同HPF之间的连接内嗅皮层(entorhinal cortex,ENTl)是外部传入的信息进入HPF的入口,HPF和ENTl参与调节恐惧记忆消退中的背景相关信息。是一个恐惧记忆消退网络的关键感觉信息输入节点,提供了与恐惧记忆消退相关的背景信息。损毁ENTl与损毁HPF类似,会导致的背景相关的恐惧记忆更新的缺陷,因此ENTl损毁的动物不能在一个新的环境形成安全的记忆,从而使得恐惧记忆消退能力受到严重的影响。ENTl投射到mBLAa但接收来自lBLAa的输入。在mBLAa共注射示踪剂结果显示,ENTl投射到mBLAa,海马的下脚接收来自lBLAa的输入。光遗传学的结果同样证明了上述的连接。3.mBLAa同其他脑区之间的连接除了与MPF和HPF存在连接外,mBLAa与可能参与恐惧记忆消除的嗅觉和丘脑区域存在连接。嗅觉信息是啮齿类动物与环境交互的初级感觉形态,是背景探索与识别中关键的一环,其相关的网络连接是背景相关记忆的一个重要组成部分。嗅觉信息通过与mBLAa存在双向连接的横向嗅束(lateral olfactory tract,NLOT)传递给mBLAa,mBLAa单向投射到后腹侧前嗅核(posterior ventral anterior olfactory nucleus,AONpv)和嗅结节(olfactory tubercle,OT),影响这些核团对嗅觉信息的处理。其他可能相关的连接到mBLAa恐惧消除通路中的核团包括丘脑室旁核(paraventricular thalamic nucleus,PVT),PVT 与 PL 存在双向连接,也投射到mBLAa。因此,PVT是mBLAa和MPF之间的相互连接的中间脑区。研究表明,PVT投射到CEA参与恐惧记忆的提取。此外,PVT接受来自脑干和下丘脑的汇聚投射,提示关于内脏,能量代谢、行为状态和昼夜节律信息参与恐惧通路中。所有的中继到mBLAa的信息有助于动物对环境进行准确的评估,并根据它们的体内环境平衡的需要来调整它们的行为。4.网络连接中的运动输出人们普遍认为CEA投射到PAG控制巴普洛夫条件性恐惧反射的僵呆行为。在mBLAa共注射示踪剂PHAL/CTb进行顺行与逆行示踪,结果发现mBLAa单向投射到CEA从而直接影响僵呆行为。事实上,自然界的恐惧中会驱使动物产生更为复杂的行为,如逃跑(逃避运动和跳跃),撕咬和预警发声。因此,虽然通过BLA-CEA连接可以调节动物面对恐惧时植物神经反应,但是其他更复杂的反应需要通过BLA输出到其他运动皮层进行调节。因此,mBLA上行单向投射到ACAd,次级运动皮层(secondary motor cortex,MOs),以及CP的背内侧部分。大量的文献证实,CP和MOs在规划和协调运动充当了重要的角色,ACAd参与了控制眼球运动从而对环境进行扫描,这对后续防御逃逸行为非常重要。从前面结果来看,所有ACAd,MOs和背内侧CP(dorsomedial CP,CPdm)只投射到杏仁体mBLAa部分,而在杏仁体的其他部分则没有投射。综上所述,皮层和纹状体运动区集中投射到mBLAa,从而使得mBLAa成为影响恐惧记忆消退的重要脑区。在条件性恐惧反射领域,对CP关注相对较少。这其中的原因可能是因为研究已经发现,以研究恐惧条件的一个基本反应为例,CP不是僵呆行为的巴甫洛夫条件化情绪反应的关键部位。然而,CP是恐惧消退连接的一个重要组成部分。首先,PL投射到CP的腹内侧部分,这提示CP参与了恐惧的表达过程。而且,投射到CP的这部分PL由mBLAa投射过来的纤维支配。此外,视觉皮层(visual cortex,VIS)和压后扣带皮层(retrosplenial area,RSP)的视觉信息传递到CPdm,提供了一个关键的感觉信息传入,在恐惧记忆消退或背景更新中调节恐惧情绪的表达。综上所述,这些证据强烈暗示CP在结构上参与恐惧记忆消退过程。另一方面,lBLAa 投射到 CP 的尾侧部(ventrolateralpart of the caudal CP,CPvl)形成了另外一个不同的网络连接。来自于初级躯体感觉皮层(primary somatosensory cortex,SSP)中的口(mouth,SSP-M)和鼻(nose,SSP-N)部、梨状皮层(posterior piriform area,PIRp)的后部,内脏皮层(visceral cortex,VISC)的颜面部、躯体和内脏信息汇聚投射到CPvl,CPvl同时还接收来自于lBLAa和背侧无颗粒岛叶皮层(dorsal agranular insular cortex,Ald)的投射。PIRp与AId也投射到lBLAa部分。而岛叶主要负责躯体和内脏的感觉,包括味觉、痛觉和其他情感、内脏运动和自主神经的控制,以及心血管功能(血压和心率的调控)和部分涉及听觉、语言功能的控制。内脏和化学感受信息的汇聚投射到CP腹外侧可以认为其参与了摄食行为。事实上,行为学的研究表明CP的这部分参与控制觅食相关的颜面部反应及支配捕猎的动作,如撕咬和捕获。总之,通过上述结果,我们确认mBLAa调节恐惧记忆的消除和背景相关的记忆更新。通过在mBLAa共注射示踪剂PHAL/CTB发现,BLAa内侧和外侧核团之间不存在相互的连接。从lBLAa传递到mBLAa的信息通路只可能通过ILA间接到达(lBLAa→ILA→mBLAa)。由于缺乏mBLAa和lBLAa之间的直接连接说明BLAa不同亚区是互相分割的,这种分割的意义在于它们可能分别控制了不同的行为。[结论]1)mBLAa与参与恐惧消退前额叶皮质中的ILA,PL,ACA,ORB存在连接。2)mBLAa与海马结构如ENT1和SUB区域相连,这些是参与定位和对特定现场的记忆消除的背景相关的记忆区域。3)mBLAa连接嗅觉区域如NLOT,AON和OT,这些区域在提供嗅觉背景相关的消退记忆中起了重要的作用。4)mBLAa接收来自丘脑核团的输入,如PVT,它与恐惧记忆提取相关。5)mBLAa单向投射到MOs,CEA和CP,使之能够影响恐惧消退的行为表达,例如僵呆行为和逃避。