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手足口病（HFMD）是一种在全球流行比较广泛的疾病。主要病原体包括柯萨奇病毒（Coxsackievirus）A组的2、4、5、6、7、9、10、16以及EV-A71,B组的1、2、3、4、5和埃可病毒等。自2012年以来,我国由非EV-A71和非CV-A16的其他肠道病毒感染所引起的HFMD的爆发越来越多。在湖南、广州、北京、福州和山东等省市超过50%,有些地区达到了80%。2017年EV-A71疫苗上市后,重症和死亡病例明显降低,但发病人数并未显著降低。为了降低HFMD的发病率,研发多价HFMD疫苗是非常有必要的。CV-A4病毒自首次分离以来,在全球多个国家和地区均出现了流行。在中国台湾出现了两次CV-A4的大流行;在2012-2013湖北武汉占比13.9%,是HFMD第四大病原体;在2011-2015年福建省,CV-A4在非EV-A71、非CV-A16病原体中占6.8%,排名第三;在2012年宁德地区,CV-A4是最主要病原,占比15.1%;2012年江苏省餘愉县,占比例为16%,排名第二。在福建、云南、广州等多地出现了由CV-A4导致的重症。另出现了CV-A4与其他多种血清型之间重组现象,这可能导致更严重的HFMD流行。研发CV-A4单价疫苗或者包含CV-A4在内的多价HFMD疫苗对于HFMD的预防和控制非常重要。此外,建立合适的CV-A4小鼠模型,对于CV-A4的致病机理研究以及候选疫苗体内效力评价极其重要。为了制备CV-A4相关检测性抗体。本研究表达了CV-A4的VP1结构蛋白,然后将CV-A4的VP1和全病毒颗粒分别免疫日本大耳白兔,获得了特异性良好的Rb-α-VP1、Rb-α-virion,为病毒鉴定及抗原的定性定量分析提供了试剂。本研究将CV-A4病毒RD细胞分离株在小鼠鼠脑和RD细胞交替传代,经过多次反复交替传代适应获得致死14日龄小鼠的CV-A4-M14-RP3,该病毒株可通过腹腔、口服和颅内三种途径感染昆明鼠。挑取8个克隆株比较了小鼠的体内毒力,获得了强毒株CV-A4-M14-613131,弱毒株CV-A4-M14-623131。对两个毒株的全基因组序列进行比对发现有8个核苷酸存在差异,其中有4个核苷酸差异导致了氨基酸的差异,可能与病毒毒力有关,分别为VP1-T2778G/D112E、3D-C5973G/I3M、3D-T7175A/W404R和3D-A7181G/K406R。通过细胞工厂培养的方式制备了攻毒库,并测定了LD50。本研究通过高感染复数传代的方式将CV-A4从RD细胞适应至Vero细胞,筛选适合作为疫苗候选株的克隆株。并在体外人工合成CV-A4疫苗候选株的全基因组序列,连接到p BR322质粒,构建CV-A4感染性c DNA克隆,通过T7体外转录试剂盒,获得CV-A4全长RNA,成功转染了Vero细胞,获得了无RD细胞遗传背景的CV-A4疫苗候选株。通过比对CV-A4 RD细胞分离株和Vero适应株的全基因组序列,发现RD细胞分离株和Vero适应株序列存在几处不同,其中同义突变的核苷酸对应位置分别为VP2-C1144T和2C-C4783T;错义突变的核苷酸和氨基酸及位置分别为:VP2-G1361A-A1362G/E137R;VP3-A2417G/I233V;VP1-G2930T/D164Y;VP1-A3354G/H305R;3D-A7322C/M454L,这些位点改变可能与细胞嗜性相关。培养病毒,纯化后得到CV-A4的空心颗粒（EP）以及实心颗粒（FP）。通过TEM、SDS-PAGE和WB对纯化的病毒颗粒的形态、纯度和特异性进行了鉴定,分别以CV-A4 EP、CV-A4 FP、CV-A4 EP+FP（EP=19.23%,FP=80.77%）、CV-A4 VLP为抗原,加入铝佐剂（终浓度为1.05 mg/m L）,制备成候选疫苗。分别以0.5μg、1.5μg、4.5μg剂量,在0和14天免疫小鼠,检测各时期血清中和抗体滴度。结果显示4种抗原均可诱导产生较高水平中和抗体,CV-A4 FP和CV-A4 EP+FP免疫原性结果无显著性差异,均优于CV-A4 EP和CV-A4 VLP。CV-A4 EP、CV-A4 FP和CV-A4 EP+FP的免疫持久性良好,均优于CV-A4 VLP。各种抗原出现明显的剂量效应和剂次效应,1.5μg为较为合适的剂量。本课题还研究了T细胞介导的免疫应答,在小鼠血清中、PBS、佐剂对照组和候选疫苗组之间活细胞中CD4+和CD8+T细胞、细胞因子无显著差异。但抗原对免疫后的肾脏细胞再刺激后,由CD4+和CD8+T细胞分泌的几种细胞因子和趋化因子的水平显著升高,表明CV-A4候选疫苗接种小鼠后,刺激特异性T细胞免疫应答。诱导体液免疫和细胞免疫（触发Th1和Th2免疫反应）,能够活化B细胞,然后分泌抗体,刺激T细胞增殖。并能产生记忆细胞,经再次刺激后,记忆细胞迅速反应,分泌各种炎性因子。最后,评估了CV-A4单价灭活疫苗的体内效力。结果显示CV-A4 FP和CV-A4EP+FP两种疫苗可以有效诱导机体产生高水平的中和抗体,能够完全抵御CV-A4病毒的致死攻击,保护率达到100%。CV-A4 VLP制备的疫苗保护率为60%。免疫组化、组织病理切片和各组织器官病毒载量结果显示CV-A4 FP和CV-A4 EP+FP制备的疫苗对小鼠的保护作用机理,疫苗接种及攻毒后的安全性良好,且保护作用优于CV-A4VLP。本课题成功制备了CV-A4候选疫苗,建立了CV-A4主动免疫保护评价模型,并使用主动免疫保护模型评价了CV-A4候选疫苗的体内效力。结果显示,CV-A4候选疫苗对小鼠有较好的保护作用。本研究为CV-A4单价疫苗或者手足口病多价疫苗的研发建立了方法、奠定了基础,具有重大意义。