东亚钳蝎(Buthus martrnsii Karsch, BmK)氯离子通道毒素(BmK CT)是一个由36个氨基酸组成、含4对二硫键的短链神经毒素蛋白,与从以色列蝎(Leiurus quinquestriatus)中分离得到的氯离子通道毒素chlorotoxin (CTX)有68%的同源性,它们有相似的生物学功能,可与神经胶质瘤细胞膜上特异表达的氯离子通道和上调表达的基质金属蛋白酶-2(MMP-2)结合,从而抑制其迁移。本课题是在实验室前期对BmK CT结构建模及分子表面静电势分析工作的基础上,研究BmK CT中碱性氨基酸残基对其功能的影响,判断BmK CT与其受体MMP-2作用的关键活性位点。通过构建相互作用的分子模型,阐明蝎氯毒素作用其受体从而抑制神经胶质瘤细胞扩散的分子机制,找到功能位点和活性表面的重要残基,深化蝎毒素的结构和功能关系研究。同时,本研究采用定点突变、蛋白表达纯化、Western Blot分析、圆二色光谱分析、细胞划痕擦伤实验、明胶酶谱等实验技术,并辅助以上计算机3D复合物结构建模加以分析。实验上,得到了电泳纯的野生及突变体蛋白,每升LB培养液可获得目的蛋白0.2M～34mg。圆二色光谱分析结果表明,BmK CT及其突变体蛋白在208nn的θ(椭圆率)值的绝对值大于222nm处,表明突变体蛋白都是以α-helix+β-sheet型存在的,与野生型BmK CT的结构类型相同。划痕擦伤迁移实验中,当突变体蛋白浓度为0.15μM作用8h时,BmK CTR14K15AA、BmK CTR17A对大鼠神经胶质瘤C6细胞的迁移抑制率约为10%左右,明显低于BmK CTK25A、BmKCTR35A对C6细胞的迁移抑制率。明胶酶谱实验中,BmK CTR14K15AA、BmK CTR17A处理组的MMP-2条带亮度高于BmK CTK25A、BmK CTR35A处理组,说明R14K15、R17三个碱性残基位点对于BmK CT发挥抑制MMP-2的活性起重要作用。通过分子建模和表面静电势分析,结果表明BmK CT及突变体分子表面的正电势与其受体MMP-2催化结构域的负电势具备通过静电相互作用的条件,且位于BmKCT中α-helix结构上的R14、K15、R17残基对维持整个分子表面的负电势较为重要。在BmK CT及其突变体与受体MMP-2催化结构域对接复合物模型分析中,我们以复合物的静电作用能和氢键的结合情况来分析BmK CT及突变体与MMP-2的亲和能力,BmK CTR14K15AA、Bmk CTR17A与受体MMP-2催化结构域复合物的静电作用能的绝对值和两者之间的氢键个数为五个复合物中最小的,从亲和力方面解释了其空间结构的不稳定性导致其抑制MMP-2活性的原因。综合上述实验和理论两个方面,我们仞步证实了R14、K15、R17位点为BmK CT中关键的碱性氨基酸位点,对BmK CT发挥抑制MMP-2活性有至关重要的影响。同时,本课题组前期利用Swiss-Model、ZDOCK服务器及Insight II2000软件包,构建了以氯通道毒素空间结构为骨架优化设计的抑制神经胶质瘤细胞迁移的高特异性的蛋白质分子序列和模型。本实验经过对BmK CT基因的定点突变、原核细胞表达及纯化,获得了以上经计算机模拟优化的蛋白,命名为Op-BmK CT。细胞擦伤划痕实验中,当Op-BmK CT蛋白作用浓度为0.12μM、处理时间为20h时,处理组划痕两侧的细胞向中间生长,划痕宽度明显变窄,迁移抑制率约为62%；面当细胞继续培养30h时,随着培养基营养消耗及蛋白与细胞表面受体作用效果的降低,Op-BmK CT处理组与BmK CT处理组的抑制率均表现下降趋势,但Op-BmK CT处理组的抑制率高于BmK CT处理组约1倍左右,推测是由于优化蛋白在总能量、表面静电作用能等方面比对照组更稳定,从而表现出优化蛋白在抑制迁移方面的优越性,实验上证实了前期我们通过计算模拟构建的这个蛋白在抑制神经胶质瘤细胞迁移方面比野生型的活性更高。此外,红色荧光纳米钻石颗粒(Fluorescent nanodiamonds, FND)因具有化学稳定性、生物相容性、表面易修饰、无毒性、光学稳定性等优点,所以非常适合做生物标记和药物的输送载体。本研究通过化学反应将BmK CT与FND偶联,探讨由FND介导的BmK CT抑制神经胶质瘤迁移的新途径,以期通过BmK CT与MMP-2的结合、FND介导的胞吞作用将神经胶质瘤表而的MMP-2胞吞回细胞内,从而达到降低迁移率的目的。细胞定位实验结果表明,当FND-BmK CT浓度为5μg/ml时,通过激光共聚焦扫描显微镜观测到细胞内存在红色荧光颗粒,表明MMP-2介导的FND-BmK CT通过细胞内吞作用可进入C6细胞。划痕擦伤迁移实验,,FND-BmK CT对C6细胞的抑制率较高约为32%,略高于FND和BmK CT处理组。细胞定位实验和划痕擦伤迁移实验都证明偶联纳米颗粒FND的BmK CT能够抑制C6细胞的迁移,北研究为FND-BmK CT抗神经胶质瘤纳米靶向制剂的研发奠定理论及实验基础本研究从分子作用机制层面阐明蝎氯通道神经毒素BmK CT与其受体的相互作用模式,对其中的功能位点和活性表面的重要残基进行鉴定,从而解释其抑制神经胶质瘤迁移的作用机制,深化了蝎毒素氯通道的结构和功能的关系研究。同时,本研究从实验上证实了本课题组前期设计的一个优化设计的基于蝎氯通道毒素CTX和BmK CT空间结构为骨架的高靶向性抗神经胶质瘤迁移的分子模型,探讨了FND介导的BmK CT抑制神经胶质瘤的可行性。本研究为抗胶质瘤新药的研发提供了理论基础和实验依据,具有良好的科学意义及社会经济意义。