最近,在小鼠和人的卵巢中发现卵母细胞干细胞,挑战了长达半个多世纪的卵巢生物学中心法则,即：雌性哺乳动物出生后,其卵巢所储存的卵泡数量是固定的,不再产生新的卵泡。这一生殖生物学新发现迫使我们重新认识卵泡的发生和卵巢的功能。但是,从首次报道分离卵母细胞干细胞后,至今没有见到进一步的有关卵母细胞干细胞的报道,而且,后续的报道与以前的报道也不完全一致。因此,在该研究中,我们首先按照发表的方法分离小鼠的卵母细胞干细胞,在此基础上,我们优化了小鼠卵母细胞干细胞分离的方法,并对建立的卵母细胞干细胞进行各种鉴定和分析。在本实验中,我们首先采用磁珠分选方法从出生2周龄左右的乳鼠卵巢内分离、纯化表达细胞表面有DDX4蛋白的卵巢细胞,分离纯化后获得细胞系4株,将其中的两株在体外培养传代30代以上,染色体核型分析显示细胞系无染色体丢失,染色体条数为40条(38+XX)。4株细胞系碱性磷酸酶染色均呈阳性,但是,随着细胞代数增加,碱性磷酸酶染色变浅,在第9代后,碱性磷酸酶的染色基本稳定。细胞免疫荧光染色证明这类细胞均表达Oct4、DDX4、C-kit、Nanog等生殖干细胞标记蛋白,采用RT-PCR基因表达分析进一步证明这些细胞的确表达有Oct4、DDX4、C-kit、Blimp1、Ifitm3等生殖干细胞标志基因。在本研究中我们简化了分离卵母细胞干细胞方法,采用了连续贴壁法首先富集了卵母细胞干细胞,简化了整个实验过程,提高了分离方法的重复性。经体外和体内实验手段对卵母细胞干细胞的发育潜能进行分析和鉴定,我们成功在体外建立了小鼠卵母细胞干细胞系。