研究背景:肾癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,我国肾癌发病率及死亡率逐年升高。肾癌的治疗从早期的细胞因子治疗时代,经历靶向治疗时代,再到如今的免疫治疗,已取得重大进展。但目前晚期肾癌仍然是一种无法治愈的疾病。临床上目前可用的系统性治疗方案对于晚期肾癌患者的存活率增加并无显著贡献,晚期肾癌患者预后较差。雷公藤红素是从中药雷公藤中提取出的有效成分之一,由于其优越的生物活性而被广泛研究。雷公藤红素对多种肿瘤包括肺癌、乳腺癌、肝癌等具有杀伤作用。但是雷公藤红素却未能在临床上得到应用,主要原因是雷公藤红素毒副作用大,限制了其临床用药浓度。雷公藤红素存在治疗窗窄、安全合理用药不易把控等问题。雷公藤红素对肾癌的作用效果目前并不明确,因此本研究对雷公藤红素治疗肾癌的效果和机制进行了研究,并通过联合PD-L1抗体来降低雷公藤红素的用药浓度,在不影响抗肿瘤疗效的前提下,降低雷公藤红素浓度过高引起的毒副作用。研究目的:本研究拟评价雷公藤红素对肾癌细胞系和小鼠皮下肾癌模型杀伤作用并对雷公藤红素治疗肾癌机制进行探索,为雷公藤红素作为潜在抗肾癌药物提供实验依据。研究方法:（1）检测雷公藤红素对SN-12C、ACHN、TK-10、A498、Renca肾癌细胞系生长或存活的影响:利用Incucyte ZOOM平台,动态观察并检测不同浓度雷公藤红素对肾癌细胞系生长或存活的影响。（2）利用转录组测序技术,检测雷公藤红素处理SN-12C和TK-10肾癌细胞系20 h后转录水平变化,探讨雷公藤红素杀伤肾癌细胞的机制。（3）用Annexin V/PI双染流式细胞术检测雷公藤红素对SN-1 2C、ACHN、TK-10、A498、Renca肾癌细胞系处理20 h后凋亡的影响。（4）Western blotting技术检测雷公藤红素处理后SN-12C和Renca肾癌细胞系凋亡相关蛋白 pro-caspase3、cleaved PARP,NF-κB 及 MAPK/p90RSK/GSK-3β/PD-L1 通路相关蛋白表达变化。（5）建立Renca细胞系小鼠皮下肾癌模型,评价在活体内雷公藤红素对肾癌的杀伤作用:在雷公藤红素处理期间,观察并测量肿瘤大小变化。21天后取肿瘤固定并进行Tunel染色检测雷公藤红素对肿瘤细胞凋亡的影响。（6）流式细胞术检测雷公藤红素处理后小鼠皮下肾癌细胞表面PD-L1的表达情况。（7）建立Renca细胞系小鼠皮下肾癌模型,评价在活体内雷公藤红素联合PD-L1抗体对肾癌的杀伤作用。（8）免疫组化技术（IHC）检测雷公藤红素处理后,小鼠皮下肾癌Ki67、p-ERK1/2、p-p90RSK、p-pGSK-3β、GSK-3β、PD-L1 的表达变化。（9）H＆E染色、PAS染色、Tunel染色技术检测雷公藤红素联合PD-L1抗体治疗肾癌对小鼠肝肾病理的影响。（10）生化分析雷公藤红素与PD-L1抗体联用对小鼠肝肾功能指标的影响。肝功能检测指标包括ALT、AST、DBIL。肾功能检测指标包括CREA、BUN。研究结果:（1）雷公藤红素对SN-12C、ACHN、TK-10、A498、Renca肾癌细胞系生长或存活具有显著抑制作用:与对照组相比,750 nM雷公藤红素处理组的肾癌细胞系存活率显著降低（SN-12C:P<0.001;ACHN:P<0.05;TK-10:P<0.001;A498:P<0.05;Renca:P<0.01）。（2）雷公藤红素引起SN-12C和TK-10转录组差异:通过对转录组测序并进行差异分析,将两个细胞系分别获得的差异基因取交集,共获得399个交集基因,其中上调基因255个,下调基因144个。差异表达基因聚类分析结果显示雷公藤红素处理组和对照组在表达模式上可以完全分开。获得的差异基因进行GO富集分析,主要富集在了细胞死亡或细胞凋亡相关生物过程。KEGG数据库中主要富集在TNF、NF-κB、MAPK、NOD-样受体、趋化因子、细胞因子与细胞因子受体相互作用、抗原处理和提呈等信号通路上,另外也富集在了类风湿性关节炎、膀胱癌等疾病中。（3）雷公藤红素促进肾癌细胞系凋亡:对雷公藤红素处理后的肾癌细胞系SN-12C、ACHN、TK-10、A498、Renca 进行 Annexin V/PI 双染流式细胞术检测表明,500 nM、1000 nM雷公藤红素可引起肾癌细胞系凋亡。Western blotting结果表明,雷公藤红素处理组与对照组相比,pro-caspase3表达降低,cleaved PA RP表达增多。（4）雷公藤红素抑制TNF、NF-κB信号通路相关蛋白的表达:Western blotting结果显示,雷公藤红素处理组与对照组相比,TNF、IL-1β、p-NF-κB和p-IκBalpha蛋白表达明显减少。（5）雷公藤红素抑制小鼠皮下肾癌模型肿瘤生长:通过构建小鼠皮下肾癌模型观察肿瘤生长变化。3 mg·g-1雷公藤红素处理组与对照组相比,肿瘤生长速度明显减缓（P<0.001）,1 mg·kg-1雷公藤红素处理组与对照组相比无明显变化。（6）雷公藤红素促进小鼠皮下肾癌模型肿瘤细胞凋亡:对小鼠皮下肿瘤进行Tunel染色,与对照组相比,3 mg·kg-1雷公藤红素处理组肿瘤出现明显的细胞凋亡。（7）雷公藤红素浓度过高引起小鼠不良反应:与对照组相比,雷公藤红素处理组小鼠均出现体重下降。3 mg·kg-1雷公藤红素处理组体重显著下降（P<0.001）,该组小鼠生存状态不佳,出现毛发湿润、脱毛、便血等不良反应。1mg·kg-1雷公藤红素处理组虽也有体重下降（P<0.05）,但小鼠生存状态良好,未出现毛发湿润、脱毛、便血等不良反应。（8）雷公藤红素促进肾癌细胞PD-L1的表达:Western blotting和IHC实验结果显示,与对照组相比,雷公藤红素处理的肾癌细胞p-Raf、p-MEK、p-ERK1/2、p-p90 RSK、p-GSK-3β、PD-L1蛋白表达显著增多,GSK-3β表达减少。流式细胞术检测显示,与对照组相比,雷公藤红素处理后的小鼠皮下肾癌细胞表面PD-L1表达显著增多（P<0.001）。（9）雷公藤红素联合PD-L1抗体增强对小鼠皮下肾癌抑制作用:与空白对照组、1 mg·kg-1雷公藤红素、PD-L1抗体单独使用组相比,联合用药组肿瘤生长速度显著减缓（P<0.01）。（10）雷公藤红素与PD-L1抗体联用对小鼠毒性检测:联合用药组与空白对照组、单独用药组对比,体重变化无显著差异。小鼠生存状态良好,未见明显不良反应。通过对小鼠肝肾进行H＆E、PAS、Tunel检测,各组均未发现明显肝肾损伤。（1 1）与对照组相比,联合用药小鼠肝功能指标ALT、AST、DBIL含量及肾功能指标包括CREA、BUN含量均未出现差异。而3 mg·kg-1雷公藤红素处理组小鼠血清中AST、DBIL显著升高（P<0.05）。研究结论:（1）雷公藤红素能够促进肾癌细胞凋亡,这种促凋亡作用是通过抑制NF-κB通路来实现的。（2）3 mg·kg-1雷公藤红素能够显著抑制小鼠皮下肾癌生长,但该浓度下小鼠体重显著下降,且小鼠会出现脱毛、出汗、便血、肝功能受损等不良反应。（3）雷公藤红素可以激活MAPK/p90RSK/GSK-3β通路,从而促进肾癌细胞PD-L1表达上调。（4）1 mg·kg-1雷公藤红素与PD-L1抗体联合使用能够显著抑制小鼠皮下肾癌生长。这种联合用药的抗肿瘤效果可能是通过激活MAPK/p90RSK/GSK-3β通路通路,上调PD-L1表达,增强PD-L1抗体的敏感性实现的。该联合用药方案未出现显著不良反应。综上所述,雷公藤红素能够通过抑制NF-κB通路促进肾癌细胞凋亡达到抗肿瘤的作用。雷公藤红素可以通过激活MAPK/p90RSK通路促使GSK-3β失活,从而促进肾癌细胞PD-L1表达。雷公藤红素与PD-L1抗体联用可增加肿瘤细胞对PD-L1抗体的敏感性,提高抗肿瘤效果。因此,雷公藤红素具有潜在的抗肾癌临床应用价值。