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γ干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)基因具有优良的抗病毒、抗寄生虫特性,在动物的免疫调节中起着关键性作用;白细胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)基因可以诱导细胞因子的产生,并促进抗体的分化;Toll样受体4(Toll-like receptor4,TLR4)是动物体内重要的病原体识别受体,在天然免疫和特异性抗感染免疫中发挥重要作用。当这些基因发生突变后可能会导致基因功能的缺失或蛋白功能的改变,从而改变机体的抗病特性,增加疾病的易感性。为进一步研究IFN-γ、IL-2、TLR4基因多态性与黄牛抗病特性之间的关系,我们以贵州三个优质品种黄牛为主要研究对象,选取了安格斯牛与杂交牛为对照。运用PCR-SSCP技术及DNA测序法,对IFN-γ基因编码区及部分内含子区、IL-2基因部分编码区、TLR4基因5’侧翼区和外显子3区的单核苷酸多态性(SNP)进行检测,以探索IFN-γ、TLR4、IL-2基因多态性与黄牛抗病特性之间的关系。并使用双抗体夹心法测定黄牛血浆中IFN-γ水平,研究结论总结如下:1.发现了黄牛IFN-γ基因两个突变位点。在思南牛群IFN-γ基因中内含子1区发现一个新的SNP位点1350T>A,优势等位基因为T,经过卡方检验,该位点的基因型和基因频率在贵州本地黄牛与安格斯牛、杂交牛之间差异均不显著(P>0.05)。在Bo IFN-γ基因外显子4区4162位点发现A>G突变,但未呈现多态。2.分析了黄牛IFN-γ基因突变位点的生物信息学意义。对IFN-γ基因1350T>A和4162A>G位点进行生物信息学分析,结果显示,1350T>A位点不影响IFN-γ基因的内含子剪切;位于外显子4编码区4162A>G位点属于同义突变。3.比较了五个品种黄牛血浆中IFN-γ含量。五个品种牛IFN-γ浓度均值大小为:关岭牛>思南牛>安格斯牛>威宁牛>杂交牛,其中关岭牛血浆中IFN-γ浓度与杂交牛IFN-γ浓度差异显著(0.01<P<0.05),根据IFN-γ浓度测定结果进行分析,推测贵州本地黄牛抗病力优于杂交牛。4.讨论了黄牛IFN-γ基因序列的保守性与抗病力之间的关系。通过讨论分析,推测贵州黄牛IFN-γ基因这种趋于保守和稳定的进化是其具有优良抗病特性的理论依据之一。5.鉴定了TLR4基因多态位点并进行了分型与命名。在TLR4基因5’侧翼区发现一个SNP位点(225G>C),产生三种基因型命名为GG、GC、CC。在外显子3区存在两个SNP位点,分别是9786C>T、9793T>C,其中9786C>T产生两种基因型命名为AA、AB,9793T>C产生3种基因型命名为AA、AD、DD。6.综合了TLR4基因突变位点的分型并分析了其生物信息学意义。TLR4基因225G>C位点多态信息含量丰富(PIC>0.25),遗传变异程度较大。针对该位点进行生物信息学分析,结果显示,225G>C位点改变了转录因子ADR1、MZF1、c-Ets-1的识别,提示该位点可以改变转录结合因子的识别从而影响TLR4表达,因此该位点具有很好的选育潜力。但该位点的基因型和基因频率在贵州本地黄牛与安格斯牛、杂交牛之间差异不显著(P>0.05)。TLR4基因9786C>T位点在五个牛群体中均处于低度多态(PIC<0.25),该突变导致氨基酸改变,由苏氨酸变成异亮氨酸,是一种亲水性氨基酸转变为疏水性氨基酸,该位点的基因型和基因频率在贵州本地黄牛与安格斯牛、杂交牛之间差异不显著(P>0.05)。TLR4基因9793T>C位点是在贵州本地牛群中新发现的SNP位点,在威宁牛群的思南牛群中处于中度多态(PIC>0.25),该位点的基因型和基因频率在贵州本地黄牛与安格斯牛、杂交牛之间差异极显著(P<0.01)。该突变导致密码子GAT向GAC变异,为同义突变,编码天冬氨酸(Asp),密码子GAC偏好性略强于GAT,但两种密码子RSCU值都趋近于1,说明两种密码子之间偏好性并无显著差异。因此以上发现的TLR4基因3个多态位点均无法反映出贵州本地黄牛与安格斯牛、杂交牛之间的抗病力差异。