食管鳞癌是一种常见的消化道恶性肿瘤,在世界恶性肿瘤发病率中居第六位,是当今世界上对人类健康危害最大的恶性肿瘤之一,中国是食管鳞癌的高发区,高发区遍及我国大江南北十余个省市,尤其在河南省林州市。随着医疗水平的提高,食管鳞癌的治疗现状较过去已有明显改善,然而,大多数食管鳞癌病人在诊断时为晚期转移癌,并且预后极差,总体带着转移的食管鳞癌病人5年的生存率不到10%。迄今为止,尚没有理想的预后和长期存活的指标来检测食管鳞癌病人,因此从分子水平上探讨食管鳞癌发生发展的分子机制有助于改善病人的预后和提高患者的生存质量。T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(T-cell lymphoma invasion and metastasis 1, Tiaml)是Habets等人于1994年发现并命名的。最初的研究表明,Tiaml参与许多种不同类型细胞的形态转化、细胞运动以及细胞的迁移过程。目前,越来越多的研究表明Tiaml在肿瘤发生发展中发挥极其重要的作用。此外,MAPK信号途径之一的p38 MAPK的支架蛋白IB2/J IP2能够与Tiaml的N2末端区域结合,促使IB2/J IP2与MLK3、MKK3和p38的结合的增强,同时也增强了Tiaml对Rac的转换作用,活化的Rac激活JNK、p38 MAPK等信号通路,引起一系列的生理病理变化,包括细胞凋亡、细胞增殖及细胞分化等过程,提示Tiaml与MAPK信号途径之间的关系密切。此外,研究显示,索拉非尼(Sorafenib)是一种口服的多激酶抑制剂,在临床前的研究中发现其可以作用于肿瘤细胞和肿瘤的脉管系统来抑制肿瘤的增殖,索拉非尼对肿瘤细胞的这种抑制的分子机制主要是在Raf激酶水平上通过靶向MAPK信号转导途径来抑制肿瘤细胞的增殖和诱导肿瘤细胞发生凋亡。上述的研究显示,Tiaml与索拉非尼的共同的交汇点可能是通过MAPK信号转导途径来调控肿瘤细胞相应的细胞生物学行为的变化,包括细胞增殖以及细胞凋亡等,从而提示Tiaml与索拉非尼之间可能存在着某种内在的联系。然而,迄今为止,Tiaml与食管鳞癌发生发展的关系以及Tiaml siRNA联合索拉非尼在食管鳞癌中的作用在国内外尚未见报道,因此,在本研究中共分为三部分来探讨Tiaml siRNA联合索拉非尼对食管鳞癌细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响,并研究其相关的分子作用机制,该研究旨在为以Tiaml为靶点、索拉非尼为辅助药的食管鳞癌的基因治疗提供理论依据。第一部分：Tiaml在食管鳞癌中的表达及其与预后的关系方法1.采用原位杂交技术检测173例食管鳞癌组织、95例癌旁不典型增生组织及173例正常食管黏膜组织中Tiaml mRNA的表达,并分析其与临床病理学参数之间的关系。2.采用免疫组织化学方法检测173例食管鳞癌组织、95例癌旁不典型增生组织及173例正常食管黏膜组织中Tiaml蛋白的表达,并分析其与临床病理学参数之间的关系。3.利用半定量RT-PCR技术检测随机选取的3例食管鳞癌组织和相对应的3例正常食管黏膜组织中Tiaml mRNA的表达。4.采用Western blotting技术检测随机选取的3例食管鳞癌组织和相对应的3例正常食管黏膜组织中Tiaml蛋白的表达。5.利用Kaplan-Meier生存曲线分析Tiaml mRNA和蛋白的表达与食管鳞癌病人预后之间的关系。6.统计学处理：半定量RT-PCR和Western blotting的相对表达结果采用Image Pro Plus 5.0软件分析,上述所有的实验至少重复3次。所有统计数据应用SPSS 13.0软件进行分析,并采用x2检验、t检验和方差分析以及相关性分析。P＜0.05表示具有统计学意义。结果1.原位杂交结果表明,Tiaml mRNA在食管鳞癌组织中表达的阳性率(87.28%)显著高于癌旁不典型增生组织(41.05%)和正常食管黏膜上皮组织(6.94%),三者之间的表达差异具有统计学意义(X2=226.049,P=0.000)。2.免疫组织化学结果表明,Tiam1蛋白在食管鳞癌组织中表达的阳性率(91.91%)显著高于癌旁不典型增生组织(49.47%)和正常食管黏膜上皮组织(9.25%),三者之间的表达差异具有统计学意义(X2=236.452,P=0.000)。3. Tiaml mRNA和蛋白的表达均与病人的性别和年龄无关(P>0.05),但是与病人的组织学分化程度、TNM分期以及淋巴结转移之间关系密切(P<0.05)。4. Tiaml蛋白和mRNA在食管鳞癌组织中的表达强度呈正相关关系(y=0.396,P=0.000)。5.半定量RT-PCR结果表明,食管鳞癌组织和正常食管黏膜组织中Tiaml mRNA在随机选取的样品1、2和3中的相对表达水平分别为0.865±0.023 vs0.396±0.011、0.591±0.015 vs 0.072±0.008和0.363+0.013 vs 0.009±0.002,其mRNA表达差异具有统计学意义(P<0.05)。6. Western blotting结果表明,食管鳞癌组织和正常食管黏膜组织中Tiaml蛋白在随机选取的样品1、2和3中的相对表达水平分别为2.353±0.059 vs1.216±0.027、1.672±0.046 vs 0.132±0.008和1.816±0.032 vs 0.008±0.001,其蛋白表达差异具有统计学意义(P<0.05)。7. Kaplan-Meier生存曲线的结果表明,Tiaml mRNA和蛋白高表达的食管鳞癌病人比低表达的食管鳞癌病人的预后差(P<0.01)。第二部分：Tiaml siRNA联合索拉非尼在食管鳞癌EC9706细胞中的作用及其分子机制研究方法1.将Tiaml siRNA通过脂质体2000转染食管鳞癌EC9706细胞,利用Real-time PCR和Western blotting技术检测转染后24h、48h及72h的Tiaml mRNA和蛋白表达的变化。2.利用免疫细胞化学检测转染Tiaml siRNA48h(?)勺Tiaml蛋白表达的变化。3.利用CCK-8试剂盒分析转染Tiaml siRNA后食管鳞癌EC9706细胞增殖能力的变化。4.利用不同浓度的索拉非尼(0、2.5μM、5μM和10μM)处理食管鳞癌EC9706细胞,采用CCK-8试剂盒检测作用24h、48h和72h食管鳞癌EC9706细胞增殖的变化。5.采用流式细胞术检测Tiaml siRNA联合索拉非尼对EC9706细胞周期和细胞凋亡的影响。6.利用Western blotting技术检测各个不同处理组中与细胞周期相关蛋白(cyclin D1和p27)和细胞凋亡相关蛋白(Mcl-1和Bcl-2)的表达。7.采用casepase-3/-9的活性检测试剂盒分析各个不同处理组的EC9706的caspase-3/-9活性的变化。8.统计学处理：利用Image Pro Plus 5.0 software分析Western blotting相对表达量,上述实验中所有的结果采用SPSS13.0软件进行统计学处理,两组数据间比较用独立样本t检验,三组数据及以上行单因素方差分析(One-way ANOVA), P<0.05具有显著性,数据以x±s表示。结果1. Real-time PCR结果表明,未处理组和对照siRNA组之间Tiaml mRNA的表达无差异,但转染后的24h的表达量大约为未处理组的1/3,但当转染48 h后,其表达量最低,约为未处理组的0.09倍。72h的Tiaml mRNA表达量与48h表达量无差异(P＜0.05)。2. Western blotting结果表明,转染Tiaml siRNA后的24 h,食管鳞癌EC9706细胞中Tiaml蛋白的表达水平显著低于未处理组和对照siRNA组(P＜0.05)但转染后的48 h,食管鳞癌EC9706细胞中的Tiaml蛋白表达最低(P＜0.05)。然而,转染后的48 h和72 h,食管鳞癌EC9706细胞中Tiaml蛋白之间的表达无差异(P＞0.05)3.免疫细胞化学结果表明,Tiaml蛋白主要定位在胞质中。在未处理组和对照siRNA组中,Tiaml蛋白呈现强表达,而在Tiaml siRNA组中Tiam1蛋白表达水平极低。4.细胞增殖结果表明,未处理组和对照siRNA组之间食管鳞癌EC9706细胞的增殖无差异(P>0.05),然而与未处理组和对照siRNA 4(?)比,Tiaml siRNA组中EC9706细胞的增殖在各个不同的时间点受到明显的抑制,显差异具有统计学意义(P<0.05)。5.索拉非尼在处理后的24 h,各个不同浓度对食管鳞癌的抑制效应无差异(P＞0.05),然而,当处理48h,10μM的索拉非尼抑制效果较佳,到72 h,仍具有明显的抑制效应(P＜0.05),但与48h相比,其抑制效率无差异(P＞0.05)。6.细胞周期结果显示,未处理组和对照siRNA组在G0/G1期的细胞数的比率分别为40.69±1.85%和41.78±1.31%,二者之间没有统计学差异(P＞0.05),而Tiaml siRNA组、索拉非尼组及联合组在G0/G1期的细胞数的比率分别为：54.48±2.14%、52.47±2.11%和65.08±1.53%,其显著高于未处理和对照siRNA组,其中Tiaml siRNA和索拉非尼联合作用最强,其在G0/G1期的细胞数的比率均显著高于其它各组组间相比差异具有统计学意义(F=91.712,P=0.000)7.细胞凋亡结果表明,未处理组和对照siRNA组早期凋亡的细胞的比率分别为：9.52±1.17%和9.24±0.83%,二者之间无统计学差异(P>0.05)。然而与未处理组和对照siRNA组相比,Tiaml siRNA组、索拉非尼组和联合组的早期凋亡的细胞比率显著升高,分别为26.06±1.00%、25.47±0.97%和33.53±1.95%,组间比较差异显著(F=228.162,P=0.000)。其中,联合组中早期凋亡的比率明显高于其它各组的早期细胞的凋亡的比率,且差异具有统计学意义(P<0.05)8. Western blotting结果显示,无论是利用Tiaml siRNA转染食管鳞癌EC9706细胞,还是用10μM索拉非尼处理食管鳞癌EC9706细胞,均能显著下调cyclin D1、Mcl-1和Bcl-2蛋白的表达,提高p27蛋白的表达,但是二者联合后,cyclin D1、Mcl-1和Bcl-2蛋白的表达水平最低,显著低于其它各组,相反p27的表达水平最高,显著高于其它各组(P<0.05)9. caspase活性分析结果表明,未处理组和对照siRNA组之间caspase-3和caspase-9的活性均无差异(均P>0.05),然而,与未处理组和对照siRNA组相比,Tiaml siRNA组、索拉非尼组和联合组中caspase-3和caspase-9的活性显著上升(P<0.05),其中Tiaml siRNA和索拉非尼的联合作用效果最佳。第三部分：Tiaml siRNA联合索拉非尼在食管鳞癌裸鼠移植瘤中的作用方法1.利用食管鳞癌EC9706细胞建立裸鼠移植瘤模型,利用Tiaml siRNA和索拉非尼治疗后比较肿瘤的体积及重量。2.利用免疫组织化学和Western blotting分析治疗前后裸鼠移植瘤中Tiaml蛋白的表达水平。3.利用免疫组织化学检测各个不同的处理组的裸鼠移植瘤中增殖相关抗原Ki-67蛋白的表达。4.采用TUNEL分析各个不同的处理组的裸鼠移植瘤中细胞凋亡的变化。5.采用Western blotting检测各个不同的处理组的裸鼠移植瘤中与细胞增殖(p27)和凋亡相关蛋白(Mcl-1和Bcl-2)的表达。6.统计学处理：应用SPSS13.0统计软件进行统计学处理,统计学数据用均数±标准差(x±s)表示,两样本均数比较采用t检验,多个样本均数比较应用单因素方差分析。以α=0.05为检验水准。结果1.未处理组和对照siRNA组中裸鼠瘤体的重量分别为：1.32±0.18g和1.30±0.19g,显著高于Tiaml siRNA组(0.37±0.09g)、索拉非尼组(0.38±0.09g)和联合处理组(0.13±0.02g)中瘤体的重量(P＜0.05),其中,联合处理组中瘤体的重量明显小于其它各个不同的处理小组(P＜0.05)。2.肿瘤生长曲线结果表明,未处理组和对照siRNA组中的肿瘤的体积在各个不同的时间点均显著高于Tiaml siRNA组、索拉非尼组和联合处理组(P＜0.05),其中联合处理组中肿瘤的体积明显小于其它各组不同的处理(P＜0.05),然而未处理组和对照siRNA组在各个不同的时间点肿瘤的体积无差异(P＞0.05)。3.免疫组织化学和Western blotting吉果表明,Tiaml siRNA组和联合处理组中Tiaml蛋白的表达显著低于未处理组、对照siRNA组及索拉非尼组(P＜0.05),而未处理组、对照siRNA组和索拉非尼组中Tiaml蛋白的表达无差异(P＞0.05)。4.未处理组和对照siRNA组的肿瘤细胞增殖指数分别为91.08±5.43%和89.35±5.22%,二者统计学上无差异(P＞0.05),然而Tiaml siRNA组和索拉非尼组的肿瘤细胞的增殖指数分别为61.36±4.33%和62.23±3.95%,明显高于联合处理组(39.17±3.17%)(P<0.05)。5.未处理组和对照siRNA组的细胞凋亡数分别为13±3和15±2,二者之间在统计学上无差异(P>0.05),而Tiaml siRNA组、索拉非尼组及联合处理组中的细胞凋亡数分别为78±9、76±11和123±15,显著高于未处理组和对照siRNA组,其中联合组中细胞凋亡数明显高于其它各组(P<0.05)。6.未处理组和对照siRNA组中p27、Mcl-1和Bcl-2蛋白表达无差异(P＞0.05)。然而,与未处理组和对照siRNA组相比,Tiaml siRNA组、索拉非尼组及联合处理组中p27蛋白的表达显著上升,而Mcl-1和Bcl-2的表达显著下调(P<0.05),其中以联合处理组中上述各蛋白的表达变化最为显著(P<0.05)。结论1.Tiaml mRNA和蛋白高表达于食管鳞癌组织,其高表达与病人的组织学分化、TNM分期和淋巴结转移有关,但与病人的性别和年龄无关,提示Tiaml可能是一种判定食管鳞癌恶性程度极其重要的分子标记。2. Tiaml mRNA和蛋白的高表达预示食管鳞癌病人的预后更差,提示Tiaml mRNA和蛋白可能作为判定食管鳞癌预后的重要分子。3. Tiaml siRNA在体内外均能有效下调食管鳞癌EC9706细胞中的Tiaml mRNA和蛋白的表达,但索拉非尼不能下调食管鳞癌中Tiaml的表达,提示二者联合具有强的抗肿瘤效应可能是其具有共同作用的分子调控途径。4. Tiaml siRNA和索拉非尼在体内外均能明显抑制食管鳞癌EC9706细胞的增殖,在体内可能与Ki-67的表达明显下调有关,提示Tiaml siRNA联合索拉非尼可能在食管鳞癌的治疗中发挥重要作用。5. Tiaml siRNA和索拉非尼均能明显诱导食管鳞癌EC9706细胞周期静止和细胞凋亡,但是二者联合产生的诱导效应最佳,其介导的细胞周期静止可能与cyclin D1和p27表达变化有关,其诱导细胞凋亡可能与Mcl-1和Bcl-2表达的降低及caspase-3和caspase-9的活性的上升有关。