猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）属于冠状病毒科,α冠状病毒属成员,是猪病毒性腹泻的主要病原之一。PEDV的感染可引起猪的流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）,尤其对哺乳期仔猪有极高的发病率和致死率,主要引起仔猪严重腹泻、呕吐、食欲下降、脱水甚至死亡。因此,深入研究宿主蛋白对抗PEDV感染机制对于研发抗病毒药物具有重要意义。本实验室前期通过蛋白质组学测序技术筛选出PEDV感染Marc-145细胞后多个差异表达蛋白,其中发现TRIM家族之一TRIM56基因表达量上调,本研究通过过表达及siRNA干扰试验确定TRIM56对PEDV增殖的影响,然后重点进行了TRIM56抑制PEDV复制的分子机制研究,获得了以下结果:1.TRIM56抑制PEDV复制。本研究用PEDV感染Marc-145细胞,通过RT-q PCR,Western blot试验发现细胞中TRIM56 mRNA和蛋白水平均显著上调;构建猴TRIM56真核过表达质粒,转染Marc-145细胞后检测过表达TRIM56对PEDV复制的影响,结果显示过表达TRIM56能够显著抑制PEDV的复制。使用TRIM56 siRNA转染Marc-145细胞,敲低TRIM56表达,PEDV复制水平显著升高。2.TRIM56显著上调IFN-β和干扰素刺激基因（ISGs）的表达。在Marc-145细胞中过表达TRIM56蛋白,PEDV感染后通过RT-q PCR检测I型干扰素和细胞因子的变化。结果显示,过表达TRIM56可明显促进IFN-β和IL-8的表达。siRNA敲低TRIM56蛋白仅削弱了IL-8的表达,不影响IFN-β的表达。这些结果表明在Marc-145细胞中过表达TRIM56可以显著诱导IFN-β表达抑制PEDV复制;siRNA敲低TRIM56对IFN-β的表达没有影响,说明TRIM56还可能通过其他抗病毒机制抑制PEDV的复制。3.TRIM56激活IRF3和NF-κB信号通路。在Marc-145细胞中过表达/siRNA敲低TRIM56,通过Western blot检测IRF3、IκBα和NF-κB磷酸化的表达情况。结果显示,TRIM56过表达可以显著上调IRF3、IκBα和NF-κB磷酸化水平,而干扰TRIM56对IRF3磷酸化的表达没有影响,只降低了IκBα和NF-κB磷酸化的水平。这些结果表明,过表达TRIM56可以通过调控IRF3和NF-κB信号通路诱导IFN-β的表达。4.TRIM56参与调控TLR3固有免疫信号通路。在Marc-145细胞中感染PEDV,Western blot检测TLR3、TRIF、TRAF3蛋白变化情况。结果显示,PEDV能够激活TLR3信号通路;在Marc-145细胞中梯度过表达TRIM56质粒,Western blot检测过表达TRIM56能够上调TRAF3的蛋白表达水平,并随着转染剂量的增多呈现上升的趋势;相反,敲低TRIM56降低TRAF3的蛋白表达水平。梯度过表达TRIM56质粒,IFN-β、ISGs和细胞因子显著上调,并且具有剂量效应。以上结果表明,TRIM56参与调控PEDV诱导的TLR3固有免疫信号通路抑制PEDV的复制。5.TRIM56 N和C端结构域对于抑制PEDV复制是必需的。构建TRIM56ΔRING、ΔN、ΔC截短突变体过表达质粒,在Marc-145细胞中过表达TRIM56及截短突变体,通过双荧光素酶检测NF-κB启动子活性,RT-q PCR检测IFN-β转录水平,Western blot、RT-q PCR和TCID50方法检测PEDV的复制水平。结果显示,只有完整的TRIM56过表达质粒具有激活NF-κB、IFN-β以及抑制病毒的能力,说明TRIM56 N和C端结构域对发挥抑制PEDV复制的功能是必需的。综上所述,PEDV感染Marc-145细胞后TRIM56蛋白显著上调,TRIM56通过调节TLR3信号通路,促进TRAF3蛋白的表达,增强了IRF3和NF-κB信号通路,最终诱导IFN-β和ISGs表达来抑制PEDV复制。天然免疫是宿主抵抗病原入侵的基本防御机制,试验结果表明了TRIM56蛋白能够通过调节天然免疫信号通路来发挥抗病毒作用。