论文部分内容阅读
目的:本实验采用高表达表皮生长因子受体细胞膜色谱(EGFR/CMC)与HPLC在线连用,从新疆准噶尔乌头生物碱及水解产物中筛选抗EGFR作用的活性成分;体外采用细胞生物实验研究筛选成分的抗类风湿活性。方法:1采用高表达表皮生长因子受体细胞膜色谱(EGFR/CMC)通过十通切换阀与高效液相色谱(HPLC)构成二维在线联用色谱系统,将CMC保留组分接液,用离线MS来鉴定准噶尔乌头中抗EGFR活性成分;通过分子对接分析活性成分与表皮生长因子受体之间的相互作用;采用MTT实验验证活性组分对人胚肾293细胞系HEK293细胞和EGFR/HEK293高表达细胞株的增殖抑制作用;2采用CCK8实验验证乌头碱,准噶尔乌头碱,水解产物苯甲酰乌头原碱对人类风湿成纤维样滑膜细胞(HFLS-RA)细胞株的增殖抑制作用;ELISA方法检测不同药物组对HFLS-RA细胞上清液中IL-6、IL-1β、TNF-α及PGE-2含量影响:采用RT-PCR和Western blot技术分别检测不同药物组对HIF-1α、VEGFA、及TLR4mRNA和蛋白相对表达水平。结果:1用EGFR/CMC-online-HPLC-MS方法分析得到,准噶尔乌头中的乌头碱、12-表-欧乌碱、准噶尔乌头碱、水解产物苯甲酰乌头原碱为作用于EGFR的有效成分;分子对接结果表明这些成分与EGFR的相互作用类似于阳性样吉非替尼:MTT实验初步验证不同浓度的乌头碱、12-表-欧乌碱、准噶尔乌头碱、苯甲酰乌头原碱均有一定的抑制作用,因此能够保留于EGFR/CMC色谱上、抑制EGFR活性,对于其抗肿瘤机制仍需深入研究;2 CCK8实验显示,不同浓度的乌头碱、准噶尔乌头碱、苯甲酰乌头原碱在对HFLS-RA细胞株均有抑制作用,其中干预24h后,准噶尔乌头碱的最佳干预浓度定为350μg/mL;苯甲酰乌头原碱的最佳干预浓度定为1000μg/mL;乌头碱的最佳干预浓度定为500μg/mL;ELISA法检测,与空白组比较,LPS对照组细胞上清液中IL-6、IL-1β、TNF-α和PGE-2含量明显升高(P<0.05);与LPS对照组比较,给药组细胞上清液中 PGE-2、IL-6、IL-1 β、TNF-α 含量显著降低(P<0.05);RT-PCR 和 Western blot法检测,与空白组比较,LPS对照组细胞内的TLR4、HIF-1-alpha、VEGFA基因及蛋白表达量明显升高(P<0.05);与LPS对照组比较,给药组细胞内的TLR4、HIF-1a、VEGF基因及蛋白表达量显著降低。结论:1在线EGFR/CMC-HPLC-MS二维色谱系统成功的从准噶尔乌头中筛选出抗肿瘤活性成分,充分展现了细胞膜色谱法操作简便,快速,高效灵敏的优势;2准噶尔乌头中乌头碱、准噶尔乌头碱、水解产物苯甲酰乌头原碱在体外均有一定的抗类风湿活性,可抑制HFLS-RA细胞的增殖,推测其抗RA的作用机制可能是抑制炎性细胞因子的产生和下调HIF-1α、VEGF和TLR4的表达水平而发挥治疗作用。