辅酶Q10(Coenzyme Q10,简写为CoQ10),又称泛醌,化学名称为2,3-二甲氧基-5-甲基-6-癸异戊烯基-1,4-苯醌。CoQ10是细胞呼吸链上的重要递氢体,生成ATP必需辅酶。CoQ10作为一种重要的脂溶性抗氧化剂,广泛存在于动植物细胞和细菌中,具有抗氧化性、消除自由基、提高机体免疫力、抗衰老等功能。已经被广泛应用于各类心脏病、癌症、急慢性肝炎、帕金森症等疾病的治疗。微生物发酵法生产CoQ10已成为最有前途的生产方法,获得优良的发酵菌株是微生物发酵法生产CoQ10的关键。由于CoQ10的生物合成途径过于复杂,通过基因工程方法改变某一或某几个关键酶基因的表达来大幅度提高发酵菌株中CoQ10的含量仍存在一定困难。传统物理和化学诱变育种技术仍是大幅度提高CoQ10的产量的重要方法。基因组改组技术是分子定向进化在全基因组水平上的延伸,将改组的对象从单个基因扩展到整个基因组。它通过多个正突变体递进融合来进行基因组随机重组,快速筛选所需表型有重大改进的菌株。基因组改组技术可以快速优化代谢途径,使由许多基因控制的表型得到改进,已经广泛的应用在各种代谢产物的生物合成中。本论文采用基因组改组的方法结合传统诱变育种方法快速融合多种正向突变,提高微生物育种效率。根据CoQ10生物合成途径及其在细胞中的生理作用确定不同的抗性筛选标记,利用多种不同的诱变方法进行诱变,得到多种突变机制和种类不同的突变体,结合不同的抗性筛选平板筛选,获取CoQ10合成不同阶段、不同层次调控发生改变的突变体,从而获得尽可能大且含有多种不同种类基因正向突变的突变体库,再以基因组改组技术进行多轮融合,得到融合有多种正向突变的CoQ10高产菌株。本论文共分三个部分:(1)高通量筛选平台建立研究;(2)传统诱变育种方法研究;(3)基因组改组条件研究。主要研究结果如下:通过实验确定了初始菌株类球红细菌Rhodobacer.sphaeroides生长及CoQ10生物合成参数;建立了高通量的筛选平台,实现对突变库的高效快速的筛选,使大规模的突变株筛选成为可能;确定了垒球红细菌诱变育种以及各种抗性标记物质的实验参数,并通过建立的高通量筛选平台筛选获得多株正向突变株;确定了基因组改组中实验参数,通过原生质体融合技术,筛选获得了多株融合了不同正向突变基因的突变株。一、建立了高通量筛选平台根据CoQ10醌环和聚异戊二烯侧链的所具有的化学结构有机特征反应,结合CoQ10在细胞中的生理活性,利用颜色反应建立了CoQ10高产菌株的快速筛选方法。通过显色系统和平板中的菌落产生肉眼可见颜色反应,实现对突变菌株的高效快速的筛选。利用碱裂解破碎法和改进的Craven test方法可以实现对初筛获得正向突变株进行CoQ10的批次的提取和含量测定,使得大规模的菌株筛选成为了可能。二、确立了各种微生物诱变参数并筛选获得高产的突变株通过对R.S生长曲线的测定,确定了R.S在5h后进入了对数生长期,在28h后其菌液的光密度值达到了峰值,开始进入稳定生长期。R.S在发酵培养到达36h后,菌体内CoQ10生物合成量达到最高。通过实验确定了紫外线(UV),硫酸二乙酯(DES),微波照射(MW)和钴60γ(Co60γ)照射的诱变处理的参数。并且基于已建立的高通量的筛选方法,对通过各种诱变处理的方法建立的突变库进行高通量的筛选,获得多株CoQ10含量提高的正向突变菌株,为随后的基因组改组建立正向的突变库。三、确立各种抗性筛选标记和基因组改组的实验参数,通过原生质体融合筛选高产突变株根据CoQ10的合成途径及作用机理,选用不同的抗性筛选标记物结合已建立的高通量筛选方法对诱变育种产生的突变库进行抗性筛选,用以筛选获得具有多种不同类型的正向基因突变株。通过实验确定了罗红霉素,卡那霉素,对羟基苯甲酸,维生素K3以及硫化钠的抗性筛选参数:罗红霉素7-10mg/L;卡那霉素9-10 mg/L;对羟基苯甲酸0.1%-0.15%;维生素K3为10-15 mg/L;硫化钠为10-15 mg/ml。并结合建立的高通量筛选平台已筛选获得了多株CoQ10含量提高的抗性突变株。其中筛选获得的突变株Na2S16通过Craven test反应,薄层层析,高效液相色谱和高分辨率质谱分析,突变株Na2S16提取样品中极有可能含有CoQ10生物合成途径中重要的前体物质。通过对原生质体融合实验因素的考察,确定各个实验参数:溶菌酶浓度为1mg/ml,溶菌酶作用时间为1h,作用温度为37℃。并通过基因组改组筛选出较出发菌株R.S中CoQ10含量大幅提高的正向突变株,其中融合了硫化钠抗性和对羟基苯甲酸抗性的PN13中CoQ10含量达到了2.39mg/g,比出发菌株提高了2.52倍。