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巨型艾美球虫(Eimeria maxima)隶属于顶复器门(Apicomplexa)、孢子虫纲(Sporozoasida)、真球虫目(Eucoccidiorida)、艾美科(Eimeriidae)、艾美属(Eimeria),是7种常见的鸡球虫之一,分布和流行广泛,也是对养殖业危害较大的球虫虫种之一。目前,鸡球虫病主要依靠药物防治和活疫苗免疫,由于药物的大量使用,球虫耐药性和抗球虫药药物残留等问题日益严重,活疫苗免疫又存在成本高、操作烦琐、免疫要求高等诸多缺陷,球虫病急需寻求防治新途径。随着分子生物学技术的不断发展,基因工程疫苗越来越受到人们的关注和青睐。DNA疫苗可诱导产生较强的细胞免疫和持久的免疫记忆,被称为第三代疫苗,在一些传染病及肿瘤的预防上取得了一定的进展,在寄生虫领域也有部分研究报道。GAM56抗原是E. maxima的配子体阶段抗原,以它为主要成分的亚单位疫苗Cox Abic?已经商品化,临床应用效果良好,本研究以GAM56基因为研究对象,构建了鸡球虫核酸疫苗,并通过鸡体试验评价了其免疫原性和免疫保护效果,旨在为其临床用于鸡球虫病的预防控制提供理论依据。1、巨型艾美球虫配子体GAM56基因核酸疫苗的构建及鉴定以含E.maxima NT株配子体基因cDNA片段的质粒pGEM-T-gam56 DNA为模板,设计一对引物,对GAM56基因含ORF的片段进行PCR扩增,扩增得到与预期大小相符的1465 bp的片段。将扩增的GAM56基因插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,经EcoRI和HindⅢ酶切鉴定和阳性重组质粒序列测定证实,GAM56片段正确的阅读框架插入了pCDNA3.1的多克隆位点,基因序列未发生变异。以切胶免疫的鼠源抗GAM56蛋白片段高免血清为一抗,FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗,对转染GAM56基因的COS-1细胞中GAM56基因表达情况进行了IFA检测。转染后72h,在部分COS-1细胞胞浆内和细胞膜上均有GAM56基因的表达,显现较强的荧光信号,证明所构建的核酸疫苗体外在真核细胞中能正确地表达GAM56基因。2、鸡巨型艾美球虫配子体GAM56基因核酸疫苗免疫原性的研究为了探讨所构建的核酸疫苗是否具有免疫原性,将pcDNA3.1-GAM56质粒分别以100μg、50μg、25μg三个剂量胸肌注射免疫黄羽肉鸡,7日龄首免,14日龄时以相同剂量和途径加强免疫一次,同时设立PBS和空质粒对照组,每组20只鸡。分别于7、14、21、28日龄每组随机抓取5只,无菌心脏采血2 mL,进行血液淋巴细胞转化试验和血清特异性抗体的ELISA检测,分析其细胞免疫和体液免疫水平的变化。结果表明:首免后7 d,DNA疫苗各剂量组即能显著增强淋巴细胞的增殖水平(P<0.05),且以pcDNA3.1-GAM56(50μg)中剂量组的淋巴细胞增殖水平最高,首免后14和21 d,淋巴细胞增殖水平继续提高。利用间接ELISA法测定抗体水平发现首免后7 d各核酸疫苗免疫组均有特异性抗体产生,其中pcDNA3.1-GAM56(50μg)中剂量组的抗体水平显著高于其他核酸剂量组(P<0.05) ,首免后14和21 d,特异性抗体水平继续提高。结果显示,该核酸疫苗具有良好的免疫原性。3、鸡巨型艾美球虫配子体GAM56基因核酸疫苗的免疫保护效果将pcDNA3.1-GAM56分别以100μg、50μg、25μg三个剂量胸肌注射免疫黄羽肉鸡,7日龄首免,14日龄时以相同剂量和途径加强免疫一次,同时设立PBS和空质粒对照组,每组10只鸡。于21日龄时,除未免疫未攻虫组每鸡经嗉囊接种5×104E.maxima NT株孢子化卵囊,7 d后称重扑杀。对各组的存活率、相对增重率、卵囊减少率等指标进行统计分析,比较免疫保护效果。结果显示,就增重而言,在三个剂量组中,pcDNA3.1-GAM56(50μg)中剂量组的相对增重率最高,达89.68%,效果最好;就卵囊产量而言, pcDNA3.1-GAM56(50μg)中剂量组能有效地减少卵囊产量,卵囊减少率最高,为53.66 %。以上结果表明,中剂量pcDNA3.1-GAM56(50μg)核酸疫苗具有良好的免疫保护效果。