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研究背景： Ig A肾病(Ig A nephropathy,Ig AN)是我国乃至全球最常见的原发性肾小球肾炎,其特征是免疫荧光下见到以Ig A为主的免疫复合物在肾小球系膜区和/或肾小球毛细血管襻沉积。据2014年最新资料显示,全球Ig AN的发病率为2.5人/10万人/每年,约20%-50%的患者20年可进展为终末期肾脏病。但是,Ig AN的发病机制仍然不十分清楚。因Ig AN患者常在上呼吸道或肠道等粘膜感染后发生肉眼血尿和/或蛋白尿,提示粘膜免疫与Ig AN的发病机制密切相关。分泌型Ig A(secretory Ig A,SIg A)是参与粘膜免疫最重要的抗体,近年来的研究发现,SIg A在Ig AN的发病中可能也起着一定的致病作用。Ig AN的病理类型及临床表现具有多样性,是否因为有SIg A的参与?SIg A可以沉积在Ig AN患者的系膜区,那么它对系膜细胞具有损伤作用吗?SIg A发挥这些致病损伤作用的机制是什么呢?迄今为止,还未见相关报道。Micro RNAs(mi RNAs)是真核生物中一类具有内源性调控功能的非编码RNA,它通过与靶基因信使RNA(messenger RNA,m RNA)的3’端非编码区(untranslated region,UTR)结合,发挥抑制翻译的作用。研究提示,mi RNAs在肾脏病中也起了重要的作用。那么SIg A是否通过作用mi RNAs来发挥在Ig AN中的致病性呢?第一部分Ig A肾病患者分泌型Ig A在肾组织的沉积以及同临床病理之间的关系目的： 检测Ig AN患者肾组织中SIg A沉积的比例;分析SIg A与临床及肾脏病理之间的关系。方法：选取263名原发性Ig AN患者,应用激光共聚焦显微镜观察肾组织SIg A的沉积,并比较有SIg A沉积和无沉积患者的临床及肾脏病理各项指标的不同。结果： 1.263名Ig AN患者中87名可见到系膜区SIg A的沉积,约占29.28%;2.同系膜区无SIg A沉积的病人相比较,有SIg A沉积的病人具有明显的感染史(P=0.016)及血尿(P=0.024)发生率,临床指标上具有明显低水平的血清胱抑素C(P=0.027)和β2微球蛋白(P=0.018),病理特征上具有更微的肾脏小管间质损伤(P=0.030)和更低的T评分(牛津分型,P=0.026)。结论： 粘膜免疫同Ig AN密切相关,SIg A参与了Ig AN的发病,它在肾组织的沉积与某些的临床肾脏病理指标相联系。第二部分分泌型Ig A在Ig AN患者肾组织激活的补体通路研究目的： 检测Ig AN患者肾组织中SIg A激活的补体通路来研究SIg A的肾损伤作用,以及比较肾组织经不同补体途径激活的Ig AN患者之间的临床病理特征。方法： 选取87名原发性IgAN患者,应用激光共聚焦显微镜观察肾组织SIgA以及各补体通路相关蛋白的沉积,探讨SIg A与各补体通路激活的关系,并比较不同补体激活通路的患者临床及肾病理特点之间的差别。结果： 1.87名IgAN患者中有22名可见到系膜区SIgA沉积,其中经旁路途径激活的占77.27%,在65名无SIg A沉积的患者中经凝集素途径激活的占72.30%,两组比较无明显差别(P=0.648);2.同肾组织经凝集素途径激活的患者相比较,经旁路途径激活的64人(73.6%)在临床指标方面具有更低的肾小球滤过率(P=0.043),在肾病理方面肾小球硬化比例(P=0.035)、小管间质损伤程度(P=0.030)、C3的免疫荧光强度(P=0.012)以及牛津评分的S(P=0.006)和T评分(P=0.039)均损伤更严重。结论： 在Ig AN中SIg A具有致病性,可能通过激活旁路途径和凝集素途径造成肾损伤;经旁路途径激活的Ig AN患者部分临床和肾病理特征比经凝集素途径激活的患者严重。第三部分分泌型Ig A对系膜细胞的生物学效应研究目的： 研究SIgA对人系膜细胞的生物学效应,探讨SIgA在IgAN中的致病作用。方法： 运用亲和层析柱提纯Ig AN患者及正常人唾液中的SIg A,应用亲和层析柱和分子筛提纯Ig AN患者及正常人血中的多聚Ig A(polymeric Ig A,p Ig A);将提纯的SIg A及p Ig A分别刺激人系膜细胞,检测细胞的增殖及各种促炎促纤维化因子(IL-6、IL-8、MCP-1、TGF-β1和纤维粘连蛋白)在细胞中m RNA及蛋白水平的表达情况,并相互比较。结果： 1.SIg A和p Ig A均能使人系膜细胞明显增殖(P<0.05),表达IL-6、IL-8、MCP-1、TGF-β1和纤维粘连蛋白明显增多(m RNA和蛋白水平,P<0.05),并且患者来源的SIg A和p Ig A对细胞的上述生物学效应均明显强于正常人来源的刺激作用(P<0.05);2.经Ig AN患者唾液纯化的SIg A对系膜细胞的增殖作用及刺激其分泌IL-6、IL-8和纤维粘连蛋白的作用要明显弱于经Ig AN患者血清纯化的p Ig A作用(P<0.05)。结论：在Ig AN中SIg A有致病作用,SIg A具有刺激系膜细胞增殖和释放促炎促纤维化细胞因子的生物学效应,并且SIg A与p Ig A对系膜细胞的生物学效应是不完全相同的。第四部分与分泌型Ig A致病性有关的micro RNAs筛选及验证目的： 筛选与SIg A致病性有关的mi RNAs,研究SIg A在Ig AN中产生致病性的分子机制。方法： 运用Agilent human mi RNAs芯片,检测经Ig AN患者及正常人SIg A刺激的系膜细胞中的mi RNAs,并分析筛选其中差异性表达的mi RNAs,应用实时荧光定量PCR分别进行验证。结果： 1.通过mi RNAs芯片筛选了17个经Ig AN患者及正常人的SIg A刺激后细胞内差异表达的mi RNAs,其中上调5个、下调12个;2.经实时荧光定量PCR验证芯片筛选结果中的mi RNAs,趋势均一致,其中16个表达差异显著(P<0.05),1个差异性不显著(P>0.05)。结论： SIgA在IgAN发挥致病性的机制中,mi RNAs参与其中。第五部分mi R-16-2-3p和mi R-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制目的： 预测和验证了miR-16-2-3p和mi R-100-3p的靶基因,进一步探讨SIgA在Ig AN中产生致病性的分子机制。方法：通过生物信息学方法对mi RNAs芯片筛选结果中的mi R-16-2-3p和mi R-100-3p进行靶基因预测,建立融合靶基因3‘UTR的荧光素酶报告基因载体,通过双报告荧光素酶基因检测方法确定mi R-16-2-3p和mi R-100-3p的靶基因;应用实时荧光定量PCR和Western blot研究mi R-16-2-3p和mi R-100-3p对其靶基因的内源性调控作用。结果： 1.成功构建了能够过表达mi R-16-2-3p和mi R-100-3p的报告基因载体;2.荧光素酶双报告基因检测显示,mi R-16-2-3p和mi R-100-3p的复制物可以分别与报告基因载体的IL-6和IL-8 3’UTR野生序列结合,使载体的荧光素酶活性降低,而IL-6和IL-8 3’UTR突变序列不能产生这样的作用(P<0.05);3.Mi R-16-2-3p过表达可以抑制SIg A刺激系膜细胞中分泌IL-6蛋白过多的情况,但不影响IL-6 m RNA的水平(P>0.05),同样mi R-100-3p过表达可以抑制其分泌IL-8蛋白过多的情况,但不能影响IL-8 m RNA的水平(P>0.05)。结论： Mi R-16-2-3p的靶基因是IL-6,mi R-100-3p的靶基因是IL-8;SIg A通过作用mi R-16-2-3p和mi R-100-3p来分别调控系膜细胞产生炎症因子IL-6和IL-8,是SIg A在Ig AN中产生致病性的分子机制之一。全文结论 SIg A参与了Ig AN的发病,它在肾组织的沉积同一定的临床肾脏病理指标相联系;SIg A在Ig AN中具有致病作用,表现在有可能激活旁路途径和凝集素途径造成肾损伤,刺激系膜细胞增殖并释放促炎促纤维化细胞因子;SIg A通过作用mi R-16-2-3p和mi R-100-3p来分别调控系膜细胞产生炎症因子IL-6和IL-8,可能是SIg A在Ig AN中发挥致病作用的机制之一。