[研究背景]膀胱癌是一类发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤,是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位。2012年全国肿瘤登记地区膀胱癌的发病率为7.61/10万,列恶性肿瘤发病率的第9位。膀胱癌可发生于任何年龄,甚至于儿童。其发病率随年龄增长而增加,高发年龄阶段为50-70岁,并且男性膀胱癌发病率为女性的4倍。膀胱癌最常见来源于尿路上皮,其发生发展是多基因参与、多种因素调控的多阶段性过程,而且肿瘤细胞的侵袭转移往往是膀胱癌主要的致死原因。因此研究膀胱癌的增殖和侵袭转移的分子机制具有重要的理论意义和临床应用价值。以往对膀胱癌的研究认为局限性的膀胱癌有效生存期为5年,但如果发生侵袭转移后则有效生存期缩短为3年。如何有效防止肿瘤侵袭转移从而延长患者的有效生存期成为临床研究的重点和难点。近来上皮与间叶样表型转化(EMT)的研究是肿瘤侵袭转移的一个研究热点。上皮与间叶样表型转化是一种基本的生理病理现象,其参与胚胎发育、组织重建和肿瘤转移,上皮细胞表型的缺失及间质特性的获得是EMT的主要特征之一。与EMT相关的信号通路有多种,其中Wnt信号通路日益受到重视。Wnt家族是一类含有丰富半胱氨酸的分泌性糖蛋白,包括19种成员,主要通过细胞表面特异性转录因子的受体参与细胞生成、细胞调节、细胞极化以及细胞迁移等。因此Wnt家族中的许多成员通过Wnt信号传导系统在肿瘤细胞的迁移、凋亡、分化、增殖中发挥着重要作用。Wnt5a是近年来备受关注的Wnt家族成员之一,它通过参与非经典的Wnt信号通路促进上皮向间质的转化,从而与肿瘤的发生和发展密切相关。但研究人员在相关研究中却得到了一个貌似矛盾的结果即Wnt5a在肿瘤组织中的表达并不一致,即在不同类型的肿瘤中Wnt5a的表达水平和所发挥的作用截然不同,即Wnt5a既是抑癌因素又是致癌因素,比如在前列腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌细胞、胃癌、胰腺癌等肿瘤中Wnt5a蛋白呈现促癌基因的特性,能够促进肿瘤的产生并且增强肿瘤的侵袭和转移能力。但在结直肠癌、白血病及神经母细胞瘤中Wnt5a往往表现出抑癌基因的特性,Wnt5a表达下调,并且抑制肿瘤的生成和转移。其中也有研究提示Wnt5a可以被看做是预后不良的一个独立危险因素。目前Wnt5a在膀胱移行细胞癌中的表达及与肿瘤发生发展和侵袭转移的关系,国内外尚无相关系统的研究报道。[研究目的]1.探讨Wnt5a与膀胱癌侵袭转移的关系以及Wnt5a在膀胱癌转移中的作用和分子机制。2.寻找膀胱尿路上皮癌转移的分子靶点。[研究内容]1.免疫组织化学和Real-time PCR检测Wnt5a在膀胱移行细胞癌组织及转移样本中的表达及临床相关性。2.利用逆转录病毒感染系统建立Wnt5a敲低和过表达的膀胱癌细胞株,并通过MTT、划痕修复实验和Transwell侵袭小室实验检测Wnt5a对人膀胱细胞癌细胞体外增殖、迁移和侵袭能力的影响。3.在已建立的Wnt5a敲低和过表达的稳定膀胱癌细胞株中,免疫印迹和Real-time PCR检测EMT的标志分子,即上皮标志物：E-cadherin、N-cadherin和间质标志物：Snail、Twist,初步探讨Wnt5a在膀胱癌转移中的潜在分子机制。[研究结果]1.免疫组织化学结果显示：在癌旁组织、乳头状瘤组织和膀胱尿路上皮癌组织中,Wnt5a的表达水平依次的升高。Real-time PCR结果显示在膀胱癌转移组织中Wnt5a mRNA表达水平最高,其次是在膀胱癌组织,乳头状瘤组织中次之,而在癌旁组织中表达最低。2.在Wnt5a稳定敲低的高转移膀胱癌细胞株J82中,免疫印迹结果显示Wnt5a蛋白表达显著降低,表明Wnt5a被成功敲低。划痕修复实验显示,Wnt5a的敲低导致膀胱癌细胞株J82的运动能力降低,Transwell侵袭小室实验显示Wnt5a的敲低导致膀胱癌细胞株的侵袭能力下降,MTT示Wnt5a敲低的膀胱癌细胞株的生长速度明显延缓。3.在Wnt5a稳定高表达的低转移膀胱癌细胞株BIU-87中,免疫印迹检测发现Wnt5a蛋白的表达明显升高,提示稳定高表达的膀胱癌细胞株成功构建。划痕修复实验显示Wnt5a的过表达导致膀胱癌细胞株的运动能力增强,Transwell侵袭小室实验发现Wnt5a过表达可导致膀胱癌细胞株的侵袭能力增强,MTT示Wnt5a过表达膀胱癌细胞株的的生长速度明显加快。4. Wnt5a被敲低后,E-cadherin和N-cadherin的蛋白和mRNA表达增加；Snail和Twist的蛋白和mRNA表达减少。而Wnt5a过表达后,E-cadherin和N-cadherin的蛋白和mRNA表达减少,Snail和Twist的蛋白和mRNA表达增加,提示Wnt5a在膀胱癌细胞株的EMT过程中发挥了关键作用。[研究结论]1.Wnt5a的表达水平与膀胱尿路上皮癌的发生、转移和浸润密切相关,提示Wnt5a可以作为判断,治疗膀胱尿路上皮癌转移的潜在指标。2.采用逆转录病毒感染方法成功构建Wnt5a稳定敲低和稳定过表达的膀胱癌细胞株。Wnt5a敲低显著抑制了高转移能力细胞株J82的生长速度以及其运动、侵袭能力,而Wnt5a过表达则促进了低转移能力细胞株BIU-87的生长速度,增加其运动、侵袭能力。Wnt5a可能成为诊断和治疗膀胱尿路上皮癌转移的分子靶点。3. Wnt5a可能通过影响EMT的标志分子E-cadherin, N-cadherin和Snail, Twist,促进肿瘤细胞的上皮间质转化,从而促进膀胱癌细胞的侵袭和转移。