论文部分内容阅读
薏贫仁为禾本科植物薏苡(Coixlachryma-jobiL.var.ma-yuen Stapf)的干燥成熟种仁,主产于福建、河北、辽宁等地。具有利水渗湿、健脾止泻、清热排脓的功效,临床上常用于治疗水肿、小便不利、脾虚泄泻、肺痈、肠痈、湿痹筋脉拘挛等。薏苡仁中含有多种化学成分,具有广泛的药理活性,其中蛋白质含量相对较高(14.17%),但目前对其蛋白及相关生物肽的研究尚少。高血压是严重危害人类健康的一种心血管疾病,化学合成的降压药虽然具有降压迅速的特点,但也存在许多不良反应,如干咳、皮疹、瘙痒等。因此,寻找安全可靠的降压药物替代品刻不容缓。本论文以薏苡仁谷蛋白为研究对象,通过酶解方法获得降压肽,采用多种手段进行分离纯化,并通过动物实验进一步证实了谷蛋白源小分子量多肽(≤≤3 KD)的体内降压活性。首先,通过顺序抽提法获得薏苡仁四类蛋白,对各类蛋白进行定量,清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白分别占总蛋白含量的1.43%、6.20%、44.74%和37.38%。薏苡仁经酸水解后进行氨基酸含量测定,共检测到15种氨基酸,其中9种为人体必需或半必需氨基酸。选用5种不同蛋白酶对谷蛋白进行水解,在[S]=2%,[E]/[S]=1:10条件下水解48h后测定水解物体外血管紧张素转化酶抑制(ACEI)活性,确定胃蛋白酶为最佳水解酶;然后以胃蛋白酶为水解酶,以蛋白水解度(OPA法)为指标,采用单因素和正交实验对水解条件进行优化,得出谷蛋白的最佳水解参数为:水解时间48 h,[E]/[S]1:5,[S]2%。采用超滤法(截留分子量3 KD)收集滤过液,制备小分子量多肽,测定其体外ACEI的IC50为201.2±12.43 μg/mL。3 KD多肽经葡聚糖凝胶Sephadex G-10分离后得到3个组分A、B、C,在1 mg/mL浓度下其体外ACEI活性分别为72.17士3.82%、69.75±1.69%、25.2±2.18%,其中A、B两个组分活性较好,进一步测得其IC50分别为91.65±6.41 μg/mL,98.78±13.8μg/AmL。A、B两组分继续进行离子交换色谱分离,得到两个活性更高的组分A2、B2,在0.5 mg/mL浓度下ACE抑制率分别为83.2±2.87%、73.1±1.89%。A2、BB2继续进行半制备RP-HPLC分离后,得到活性部位更集中的四个组分A2-2、A2.8、B2-2、B2-4,在 0.1 mg/mL 浓度下其体外 ACEI 活性分别为 93.66±0.22%、73.23±3.86%、91.96±3.30%、89.70±2.40%,比同等浓度下A、B两组分的ACEI活性(分别为18.62±1.26%、10.28±0.92%)提高了 5倍以上,具有较大的降压潜力。动物实验以SHR为材料进行谷蛋白小分子肽体内药效学研究。单次给药实验结果表明,谷蛋白多肽100 mg/kg低剂量组、200mg/kg中剂量组、400mg/kg高剂量组血压在给药4h后下降至最低,分别比给药前下降了 13.2mmHg、21.5 mmHg、32.5 mmHg,卡托普利组(20 mg/kg)SHR在给药6 h后血压降至最低值(161.8±3.3 mmHg),与相同时间空白组血压相比显著降低,且多肽给药组的降压效果呈剂量依赖性。长期给药实验结果显示,给药10 d后,300 mg/kg多肽剂量组、450 mg/kg多肽剂量组和卡托普利组(20 mg/kg)SHR的血压分别降至154.5±3.2、149.0±3.4、153.9±2.8 mmHg,比同时间SHR空白组血压显著降低,而给药过程中Wistar大鼠血压(118.1±4.5 mmHg)无显著变化。给药10d后卡托普利组、300mg/kg、450mg/kg多肽剂量组AnglⅡ水平分别为819.6±346.5、513.4±199.6、388.7±145.3 pg/mL,与空白组(542.5±295.9pg/mL)相比无显著差异,血浆肾素活性(PRA)水平分别为59.66±48.16、29.03±29.29、27.01±14.46 ng/mL·hr,只有卡托普利组PRA水平显著高于空白组(31.23±18.82ng/mL·hr),其它两组与空白相比无显著差异。本研究表明薏苡仁谷蛋白经体内胃蛋白酶水解后,可释放具有降压活性的多肽。因此,长期服用薏苡仁可以达到一定的降压功效,同时具有开发成为新型保健食品的潜力。