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miRNAs在组织器官发育、疾病发生、细胞增殖凋亡等生物学过程中起着重要的调控作用。本课题组在前期研究中发现miR-2954在鸡胚性腺及其它组织中呈雄性显著高表达,且通过靶向YY1等基因,可能在鸡性腺分化及发育过程起着重要的调控作用。然而,miR-2954在雄性性腺发育中的作用及分子调控机制还需在动物活体内进行证实。针对如何在鸡体内进行有效的miRNA功能研究的问题及确定YY1在睾丸发育中的作用,本研究采用了CRISPR/Cas9技术构建针对鸡miR-2954的慢病毒载体,验证该系统是否能在鸡原代睾丸支持细胞中进行有效的基因编辑;同时,利用超表达结合RNA-seq技术研究miR-2954的靶基因YY1在鸡睾丸支持细胞中的调控作用。本研究成果如下:1.通过在线设计并筛选鸡miR-2954前体序列的4个sgRNA,选用pLenti-sgRNAeGFP、LentiCRISPRV2GFP、Lenti-sgRNA-CAS9-mcherry三种不同的慢病毒表达载体构建了miR-2954 sgRNA的CRISPR/Cas9重组载体。2.将CRISPR/Cas9重组质粒转染鸡DF-1细胞系,通过T7E1酶切、突变子测序及miR-2954的定量检测,验证了鸡miR-2954的4个sgRNA均有基因编辑能力,且Lenti CRISPRV2GFP载体介导的sgRNA3效果最好。3.对携带不同荧光蛋白的LentiCRISPRV2GFP和Lenti-sgRNA-CAS9-mcherry的s gRNA3重组载体在293T细胞中进行慢病毒包装及滴度检测,结果表明Lenti-sgRNA3-CAS9-mcherry的病毒滴度达2E+8TU/mL,可成功地感染鸡原代睾丸支持细胞。4.在鸡睾丸支持细胞中进行miR-2954靶基因YY1的过表达,定量PCR检测结果显示,与对照组相比,超表达组中YY1的表达量极显著上调。5.YY1超表达和对照组的转录组测序一共发现了2955个差异基因,其中2136个上调,819个下调。通过GO和KEGG分析,发现这些基因大多集中于支持细胞对于精原细胞调控的通路上。同时也发现了支持细胞调控精原细胞最主要的两个基因,AR和INHBA,在超表达YY1之后表达量也出现了显著差异。这表明miR-2954可能通过调控YY1来影响支持细胞分泌相关的细胞因子和激素来影响雄性精原细胞生成及分化,从而来调控性腺发育。