【摘 要】
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角质细胞生长因子（Keratinocyte Growth Factor）是成纤维细胞生长因子家族的一员，它通过与受体（KGFR）的结合，特异性地刺激上皮细胞的增殖，对皮肤、胃、肠、肾、膀胱、肺等上皮的损伤有修复作用，能减少放化疗所带来的副作用。而N端前23位氨基酸残基缺失后的截短型KGF(KGFdes1-23)具有更高的稳定性和活性。为了制备高纯度和高活性的人截短型KGF，本研究采用基因重组技术，
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角质细胞生长因子（Keratinocyte Growth Factor）是成纤维细胞生长因子家族的一员，它通过与受体（KGFR）的结合，特异性地刺激上皮细胞的增殖，对皮肤、胃、肠、肾、膀胱、肺等上皮的损伤有修复作用，能减少放化疗所带来的副作用。而N端前23位氨基酸残基缺失后的截短型KGF(KGFdes1-23)具有更高的稳定性和活性。为了制备高纯度和高活性的人截短型KGF，本研究采用基因重组技术，选择单一、融合和分泌三种表达方式构建了多个不同的原核表达菌株，并构建了巴斯德毕赤酵母胞外和胞内表达两种菌株，分析了不同菌株的表达情况。本研究还摸索了表达菌株的发酵工艺、探索了不同形式表达产物（包涵体、可溶蛋白和融合蛋白）的纯化工艺。本研究还通过蛋白N端测序和免疫印迹对目标蛋白进行了鉴定。最后，采用上皮细胞和间质细胞进行了促细胞增殖活性的检测。最终，我们得到了两个原核表达菌株，初步建立了纯化工艺并获得少量的目标产物；蛋白N端测序和免疫印迹验证结果表明，表达产物与理论设计的人KGFdes1-23相符；细胞实验显示，本研究获得的表达产物对上皮细胞有明显的促增殖活性。另外，我们对KGFdes1-23蛋白的突变体进行了同源模建，通过分析其突变前后的原子位移均方根偏差构象变化，找出可能的重要位点，并通过基因重组的方法进行了初步的分析验证。
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磷酸化修饰是生物体内最重要的蛋白质翻译后修饰之一,蛋白质的磷酸化与去磷酸化过程是真核细胞生命活动最普遍的调控手段。蛋白质的磷酸化与去磷酸化过程,调控着包括信号转换、基因表达、细胞周期等诸多细胞过程。因此,对蛋白质磷酸化修饰的分析是蛋白质组研究中的重要内容。对磷酸化蛋白质的检测和磷酸化位点的确定是认识蛋白质磷酸化在生命活动中调控机制的重要参考信息,用蛋白质组学的策略研究生物体的磷酸化修饰也是功能蛋白
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