研究背景CHIP（carboxyl terminus of Hsc70/Hsp70-interacting protein）是Ballinger等人1999年在筛选含TPR（tetratricopeptide repeat ）结构域蛋白时,从人的心脏cDNA文库中发现的,并将其命名为CHIP。CHIP蛋白在进化上高度保守,其N末端含有3个重复的TPR结构域,该结构域可以与热休克蛋白（Hsp）70、Hsp90相互作用。C末端含有U-box结构域,其与环指（RING fingers）结构域相似,具有E3泛素连接酶功能。连接N端及C端的中间区含有两个核定位信号序列,但其功能不明。CHIP的特殊结构特征使其成为沟通分子伴侣与泛素-蛋白酶体通路之间的桥梁,是蛋白质量控制系统的重要中介分子。以往的研究表明,CHIP分子可以通过重塑Hsp90异源复合物来介导多种Hsp90底物蛋白分子经泛素-蛋白酶体通路降解,如生长因子受体ErbB2/neu、雄激素受体（AR）、雌激素受体（ER）、糖皮质激素受体（GR）及突变型p53蛋白等。此外CHIP可以介导Hsp70底物蛋白及一些变性或错误折叠蛋白分子的降解,如囊性纤维化跨膜转导受体（CFTR）、热变性荧光素酶及神经退行性疾病中异常积累的蛋白tau、α-突触核蛋白等。热休克蛋白（heat shock proteins,Hsp）是细胞内重要的分子伴侣蛋白,能够参与细胞内一些重要蛋白分子的构象、稳定性及激酶活性的调节。此外,热休克蛋白还能对应激状态下的细胞提供保护。近年来的实验研究发现,在热休克蛋白家族成员中,Hsp90分子具有特殊的分子伴侣功能,参与了众多与肿瘤细胞增殖和凋亡调控信号相关的分子构象与稳定性的调节,在肿瘤细胞的异常增殖、药物耐受及抗凋亡信号通路活化方面扮演着重要的角色。与Hsp90结合的底物蛋白中包括肿瘤特异性蛋白（如突变型p53和Bcr-Abl）;激酶蛋白（如v-Src、ErbB2、Raf-1、Akt、Cdk4、Cdk6等）;细胞膜生长因子类受体,如表皮生长因子受体（EGFR）、血小板衍生生长因子（PDGF）和胰岛素生长因子受体（IGFR）等;核受体（如ER,AR）等。这些底物蛋白在肿瘤细胞增殖信号转导及抗凋亡过程中起着举足轻重的作用。Hsp90的分子伴侣功能对于维持其底物蛋白构象、激酶活性及蛋白分子的稳定性是至关重要的,当Hsp90分子伴侣功能受到抑制时,这些底物蛋白会失去与Hsp90的结合而通过泛素-蛋白酶体通路降解。有丝分裂是一个非常复杂和精细的调节过程,有大量的调节蛋白参与包括中心体循环、纺锤体检查点、微管-着丝粒黏附、纺锤体组装和染色质凝聚等有丝分裂事件。有丝分裂期的调控主要依赖于两类翻译后修饰机制:磷酸化和蛋白水解。这两类调控机制密切相关,蛋白水解被磷酸化所调控,同时有丝分裂激酶也因被水解而表达下调。有丝分裂调控蛋白的异常表达会影响细胞正常的有丝分裂过程,诱导出现染色体分离滞后、多极纺锤体形成等异常有丝分裂现象,进而导致多倍体细胞形成和肿瘤发生。泛素-蛋白酶体通路被认为参与介导有丝分裂相关蛋白的降解。鉴于慢性髓系白血病CML的理想靶向治疗分子Bcr-Abl是Hsp90的底物蛋白,那么分子伴侣依赖的E3泛素连接酶CHIP是否参与了Bcr-Abl的降解过程呢?在本研究我们建立了稳定高效表达野生型及突变体CHIP的慢性髓系白血病K562细胞模型,探讨CHIP在Bcr-Abl降解过程中的作用。此外,我们在实验中发现过表达野生型CHIP的K562细胞中出现异常有丝分裂现象,我们针对有丝分裂调控蛋白的表达及定位对相关机制进行探讨,并利用蛋白质组学技术筛选CHIP可能的底物蛋白。研究内容及结果:1. K562-CHIP稳定表达株的鉴定及其生物学特性采用K562细胞成功建立了可稳定过表达野生型CHIP（K562-CHIP）及其TPR及U-box结构域突变体（K562- TPR, K562- U-box）的细胞克隆,Western Blotting和免疫荧光实验分别证实了外源CHIP的表达。K562-CHIP与各对照细胞相比生长速率无明显差异,G2/M期比例略有升高。瑞氏-姬姆萨染色发现K562-CHIP出现特殊形态异形核细胞和巨型细胞,有丝分裂期细胞比例增加。K562-CHIP对组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂FK228和作用于微管的抗肿瘤药物Taxol的杀伤敏感性与对照相比无明显差异。过表达野生型CHIP在生理状态下不能介导Bcr-Abl通过泛素-蛋白酶体通路降解,在Hsp90功能受抑制的情况下亦不能协同FK228降解Bcr-Abl。2.过表达野生型CHIP诱导K562细胞有丝分裂灾变Hoechest 33258染色发现K562-CHIP细胞出现异常有丝分裂现象,主要表现为特殊形态异形核、染色体分离滞后和多极纺锤体形成等。染色体乘客复合体蛋白AuroraB、Survivin及着丝粒外板蛋白BubR1、CENP-E在特殊形态异形核细胞中均丧失与着丝粒的共定位,而Plk1激酶和外板蛋白Bub1在着丝粒的定位则未受影响。此外K562-CHIP细胞显示AuroraA激酶扩增及纺锤体形成异常。除多极纺锤体外,还可见单极及不对称纺锤体。而转染U-box结构域缺失体的K562细胞未见类似改变。免疫荧光染色首次发现CHIP在K562细胞及MCF-7细胞中除定位于胞浆外,还可定位于中心体,并可随有丝分裂进程呈现移动至纺锤体及中体的改变。3.过表达野生型CHIP对K562细胞蛋白表达谱的影响双向电泳检测结果表明K562和K562-CHIP细胞蛋白表达谱中存在39个差异蛋白点,其中表达下降的蛋白点20个,表达上升的蛋白点19个。利用MALDI-TOF-MS对差异蛋白点进行肽质量指纹谱分析,结果经Mascot（www.matrixscience.com）软件在SwissProt和NCBInr数据库内进行检索,共鉴定出28个蛋白点,对应20种不同的蛋白。根据生物学功能不同,20种鉴定蛋白分别属于细胞骨架、能量代谢、蛋白折叠、转录调控、蛋白降解和免疫调控6大类结论:1. K562细胞过表达野生型CHIP不影响其生长速率以及对于抗肿瘤药物FK228和Taxol的药物敏感性,K562-CHIP细胞G2/M期比例略有增加。野生型CHIP可诱导K562细胞中出现特殊形态异形核细胞和巨型细胞。2.过表达野生型CHIP在生理状态下不能介导Bcr-Abl通过泛素-蛋白酶体通路降解,在Hsp90功能受抑制的情况下亦不能协同HDAC抑制剂FK228降解Bcr-Abl,提示CHIP对Hsp90的底物具有高度选择性。3.过表达野生型CHIP可诱导K562细胞中出现异常有丝分裂现象,主要包括特殊形态的异形核、染色体分离滞后和多极纺锤体形成等。过表达野生型CHIP诱导染色体乘客复合体蛋白AuroraB、Survivin及着丝粒外板蛋白BubR1、CENP-E在特殊形态异形核细胞中丧失与着丝粒的共定位,而Plk1激酶和外板蛋白Bub1在着丝粒的定位则未受影响。野生型CHIP亦可诱导AuroraA激酶扩增及纺锤体形成异常。除多极纺锤体外,还可见单极及不对称纺锤体。而转染U-box结构域缺失体的K562未见类似改变。4.免疫荧光染色首次发现CHIP在K562细胞及MCF-7细胞中除定位于胞浆外,还可定位于中心体,并可随有丝分裂进程呈现移动至纺锤体及中体的改变。