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牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)感染引起的犊牛肺炎、关节炎、乳房炎、角膜炎等与牛支原体相关的疾病简称为牛支原体相关疾病(Mycoplasma bovis-associated disease,Mb AD)。Mb AD是引起我国养牛场中犊牛死亡的主要疾病之一,但是牛支原体的致病性及致病机制尚不十分清楚。天然免疫应答是脊椎动物对抗入侵的外界微生物的第一道防线。天然免疫细胞主要包括上皮细胞、中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞等。作为宿主天然免疫细胞的重要一员,上皮细胞通过直接清除病原微生物和释放相应的细胞因子和趋化因子来招募其它免疫细胞到感染部位来发挥其免疫学功能。肺脏是牛支原体感染的靶器官,研究肺上皮细胞对抗牛支原体及其重要毒力蛋白的免疫应答,可以帮助我们理解宿主细胞的防御策略和相应的牛支原体的逃避策略。胎牛肺细胞(embryonic bovine lung cell,EBL cell)是用怀胎7个月左右的胎牛肺组织建立的一种原代细胞。该细胞是研究牛的病毒性、细菌性疾病的重要细胞模型。支原体膜表面存在着大量的脂质相关膜蛋白(lipid-associated membrane proteins,LAMPs)。支原体LAMPs是介导支原体粘附宿主、入侵宿主的基础。同时,支原体LAMPs能够与细胞膜表面受体结合,激发宿主细胞因子的释放。在本研究中,以EBL细胞为细胞模型,研究宿主在牛支原体LAMPs刺激下释放IL-1β的分子机制。1.牛天然免疫信号通路关键分子的克隆及其重组质粒的构建克隆牛NF-κB信号通路及上游Toll-like receptor信号通路中关键信号分子TLR1,TLR2,My D88,IRAK4和p65,并构建其重组质粒:p CMV-HA-TLR1;p CMV-HA-TLR2;p CMV-HA-My D88;p CMV-HA-IRAK4和p EGFP-p65等,为后文牛支原体LAMPs诱导EBL细胞IL-1β释放的分子机制研究提供工具。2.牛支原体LAMPs诱导EBL细胞IL-1β释放的分子机制研究以EBL细胞为细胞模型,将一定量的热致死的M.bovis和活的M.bovis分别刺激EBL细胞,应用SYBR Green I Real-time PCR检测EBL细胞IL-1β的表达水平。结果证实,活的M.bovis及热致死的M.bovis均能够诱导EBL细胞IL-1β的产生。另一方面,应用牛支原体LAMPs刺激EBL细胞,发现牛支原体LAMPs也能够诱导EBL细胞IL-1β的产生,且呈时间及剂量依赖。进一步,应用激光共聚焦显微镜和Western Blotting技术,证实,牛支原体LAMPs能够诱导EBL细胞转录因子p65转核从而激活NF-κB信号通路,诱导下游IL-1β的释放,且跨膜受体TLR2在此过程中发挥着重要的作用。