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目的:在众多恶性肿瘤中,肺癌的发病率与病死率一直呈现居高不下的态势,通过肺癌的早期诊断可以更好的提高肺癌患者的治愈率,并且提高患者的生存率,这对提高肺癌患者的预后,意义重大。纤维支气管镜检查是肺癌的主要诊断方法,同时刷检、针吸及冲洗是活检的重要补充;其优点在于:良恶性细胞的鉴别主要依据形态特征分析,一般没有机会借助免疫细胞化学诊断;细胞学诊断同样面临着临床手术治疗的严峻考验;某些周围形、表面破溃重及肺门淋巴结病变,无法进行活检时刷检细胞的形态特征分析便显得尤为重要。众所周知,恶性肿瘤细胞与其同源正常细胞比较,具有不同的代谢方式[12],即使在有氧条件下,要通过糖酵解方式消耗更多的葡萄糖获取能量,这种独特的代谢方式称为(Warburgeffect)。葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter1,GLUT1)是完成Warburg effect的主要因子,是细胞葡萄糖跨膜转运的主要载体。前期工作中,我们应用RT-PCR方法,发现在肺癌患者支气管刷检细胞中高表达[9]。然而,在肺癌细胞中是否与细胞的增殖、迁移、侵袭能力及凋亡情况密切相关目前尚不清楚。本课题运用双标准曲线qRT-PCR方法定量检测支气管镜刷检标本中,良恶性细胞中的GLUT1mRNA表达情况,并运用细胞功能学实验检测GLUT1对肺癌细胞系A549的增殖、迁移、侵袭能力及凋亡情况的关系,以及可能存在的通路。探讨其对肺癌早期诊断、治疗以及预后的临床应用价值。 材料和方法:收集中国医科大学附属第一医院2014年12月至2015年2月门诊及住院患者术前纤维素支气管镜刷检细胞标本104例、其中肺癌64例(包括鳞癌40例,腺癌24例)以及肺部良性疾病40例(包括炎症37例,结核3例)。所有病例均为经验丰富的临床支气管镜医生取得,并且经细胞学、组织学证实。应用Quantitative real-time PCR方法检测支气管镜刷检细胞中GLUT1mRNA的表达情况。应用人正常支气管上皮细胞系HBE以及5种肺癌细胞系,检测GLUT1在其中的表达情况。应用MTS实验、集落形成实验检测肺癌细胞增殖,Western blot实验检测肺癌细胞周期相关蛋白表达水平。运用划痕实验、Transwell实验、细胞凋亡实验、Western blot实验检测肺癌细胞迁移、侵袭、凋亡以及与迁移、侵袭相关蛋白的表达。 结果:GLUT1mRNA在肺癌支气管镜刷检细胞细胞中,恶性组、腺癌组和鳞癌组支气管镜刷检细胞中GLUT1的表达水平明显高于良性组(P<0.05)。Western Blot实验结果显示:H460(大细胞癌)和LK2(鳞癌)中GLUT1蛋白均呈相对低的表达,HBE和H1299(腺癌)中GLUT1蛋白呈中等强度表达,而A549(腺癌)、SK(鳞癌)中GLUT1蛋白显示较高表达水平。选择GLUT1蛋白高表达的A549为后续实验细胞系。在A549细胞系中干扰GLUT1的表达后,MTS实验与集落形成实验提示肿瘤细胞的增殖较对照组明显下降(P<0.05)。干扰GLUT1的表达后可以使肺癌细胞cyclinA、cyclinD1、cyclinE、CDK4、CDK6表达明显减少,CDK2表达轻度下降,P53、P130表达增多,而对P21、pRB无影响。划痕实验、Transwell实验提示肿瘤细胞的迁移以及侵袭能力明显下降(P<0.01)。Western Blot实验结果显示:迁移相关蛋白ROCK1、ROCK2的表达明显下降,RhoA蛋白的表达没有变化。侵袭相关蛋白MMP1、MMP2、proMMP2、MMP9蛋白的表达明显下降,TIMP2蛋白的表达明显增加。凋亡实验结果显示:肿瘤细胞的凋亡增加。利用Western blot方法检测干扰A549细胞系中GLUT1的表达后,integrinβ1、FAK与Src以及磷酸化的FAK(磷酸化位点Tyr576/577)、Src蛋白(磷酸化位点Tyr530)的表达降低,CD44没有变化。提示GLUT1可以通过integrinβ1/Src/FAK信号通路调节肺癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡。 结论:1、GLUT1 mRNA在支气管镜刷检细胞中,良恶性细胞的表达有明显差异,在恶性细胞中过表达;2、GLUT1能够促进肺癌细胞的增殖,抑制凋亡以及对细胞周期的调控;3、GLUT1能够促进肺癌细胞的迁移和侵袭:4、GLUT1可以通过integrinβ1/Src/FAK信号通路调节肺癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡。